伊利諾伊大學(xué)Bill Metcalf的微生物學(xué)教授G. William Arends與博士后研究員Dipti Nayak進行的一項新研究首次記錄了CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯在生命的第三個領(lǐng)域Archaea中的應(yīng)用。他們在美國國家科學(xué)院院刊上發(fā)表的開創(chuàng)性工作有可能大大加速這些生物的未來研究，對包括全球氣候變化在內(nèi)的研究產(chǎn)生影響。Metcalf和Nayak是伊利諾伊州Carl R. Woese基因組生物學(xué)研究所的成員。

“在大多數(shù)情況下，與大腸桿菌相比，我們的模型古菌Methanosarcina acetivorans的倍增時間為8到10小時，大腸桿菌可以在30分鐘內(nèi)翻倍。這意味著做遺傳，獲得突變體，可以采取幾個月 - 同樣的事情在大腸桿菌中需要三天，“Nayak解釋說。“在一個非?；A(chǔ)的層面上，CRISPR-Cas9使我們能夠做的是加速整個過程。它消除了一個主要的瓶頸......在與這個古菌進行遺傳學(xué)研究時。“甚至更多，”Nayak繼續(xù)說道，“通過我們以前的技術(shù)，突變必須一步一步地引入。使用這種新技術(shù)，我們可以同時引入多個突變。我們可以擴大突變體生成過程的指數(shù)級與CRISPR。“

CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats的縮寫，最初是古細(xì)菌和細(xì)菌的免疫防御系統(tǒng)。通過識別和儲存外源DNA的短片段，Cas(CRISPR相關(guān)系統(tǒng))蛋白能夠在將來快速識別該DNA，從而可以迅速將其破壞，保護機體免受病毒入侵。

自發(fā)現(xiàn)以來，該免疫系統(tǒng)-TXF-Cas9的一個版本已經(jīng)過修改，可以在實驗室中編輯基因組。通過將Cas9與特異性工程RNA導(dǎo)向而非侵入性DNA片段配對，可以指導(dǎo)CRISPR系統(tǒng)在任意位置切割細(xì)胞的基因組，從而可以移除現(xiàn)有基因或添加新基因。該系統(tǒng)在編輯從酵母，植物，魚類甚至人類細(xì)胞的真核系統(tǒng)方面具有豐富的經(jīng)驗，并獲得了美國科學(xué)促進會2015年度突破獎。然而，它在原核物種中的實施遇到了障礙，部分原因在于其不同的細(xì)胞過程。

為了在細(xì)胞系統(tǒng)中使用CRISPR，研究人員必須開發(fā)一種方案，該方案考慮了細(xì)胞優(yōu)選的DNA修復(fù)機制：在CRISPR的“分子剪刀”切割染色體后，細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)通過一種機制介入以修復(fù)損傷。可以利用去除或添加其他遺傳物質(zhì)。在真核細(xì)胞中，這采用非同源末端連接(NHEJ)的形式。雖然這種途徑已被用于CRISPR介導(dǎo)的編輯，但它有在其修復(fù)過程中引入遺傳錯誤的趨勢：核苷酸，DNA梯的梯級，通常在切割位點添加或刪除。

NHEJ在原核生物中非常罕見，包括古細(xì)菌; 相反，他們的DNA通常通過稱為同源定向修復(fù)的過程進行修復(fù)。通過比較DNA模板的損傷，同源定向修復(fù)創(chuàng)造了Nayak所謂的“確定性模板” - 最終結(jié)果可以提前預(yù)測并根據(jù)研究人員的確切需求進行調(diào)整。

在許多方面，同源定向修復(fù)實際上更適合基因組編輯：“盡管我們希望CRISPR-Cas9在真核系統(tǒng)中進行定向編輯，但由于NHEJ，我們常常得到我們不想要的東西，” Nayak解釋道。“在這方面，大多數(shù)古菌菌株不具有非同源末端連接修復(fù)系統(tǒng)是一件好事，因此DNA可以修復(fù)的唯一方法是通過這種確定性的同源修復(fù)途徑。”

雖然看似違反直覺，但Nayak和Metcalf首次使用CRISPR-Cas9之一是在Methanosarcina acetivorans中引入NHEJ機制。Nayak說，雖然一般不喜歡基因組編輯，但NHEJ有一種用途，它優(yōu)于同源修復(fù)：“如果你只是想刪除一個基因，如果你不關(guān)心如何...非同源末端連接實際上更高效。”

通過使用引入的NHEJ修復(fù)系統(tǒng)進行所謂的“敲除”研究，其中單個基因被移除或沉默以查看產(chǎn)生的變化以及該基因可能影響的過程，Nayak說未來的研究將能夠組裝M. acetivorans和其他古菌種的遺傳圖譜。這樣的地圖集對于涉及古細(xì)菌的各種研究領(lǐng)域非常有用，包括Metcalf實驗室特別感興趣的領(lǐng)域，即氣候變化。

“Methanosarcina acetivorans是最易遺傳的古菌菌株之一，”Nayak說。“[產(chǎn)甲烷菌]是一類古菌，每年產(chǎn)生這種強效溫室氣體的千兆噸，在全球碳循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，因此對全球氣候變化做出了重大貢獻(xiàn)。” 通過研究這種和類似生物的遺傳學(xué)，Nayak和Metcalf希望不僅能夠更深入地了解古生物遺傳學(xué)，還希望它們能夠在更廣泛的環(huán)境過程中發(fā)揮作用。

總之，這項研究代表了研究和操縱古菌的一個令人興奮的新方向。“我們開始這項研究，以確定是否有可能在古細(xì)菌中使用CRISPR-Cas9基因組編輯，”Nayak總結(jié)道。“我們發(fā)現(xiàn)它不僅是可能的，而且與真核系統(tǒng)相比，它的效果非常好。”