遺傳學家一直在使用模式生物，從家養(yǎng)小鼠到單細胞面包酵母，釀酒酵母，研究調(diào)節(jié)人類發(fā)育和生理學的基本生物過程，并且可以在各種疾病中受到損害。這是可能的，因為在人類中控制這些過程的許多基因在其他物種中也具有相似的功能;并且因為模型生物中的基因可以在實驗室中隨意突變和刪除。然而，到目前為止，即使在易于操作的酵母中，基因也必須一次刪除一個基因，通常在其基因組中留下額外的不希望的序列修飾。

哈佛大學Wyss學院的一個團隊由其核心學院成員George Church領導，現(xiàn)在提出了一種基于CRISPR-Cas9的自然生物技術戰(zhàn)略，解決了這兩個問題。使用面包酵母，研究人員開發(fā)了一種高通量方法，允許研究人員在單個酵母細胞中同時精確地改變單個基因的數(shù)百種不同基因或特征，效率為80%至100%，從顯示特定行為的群體中選擇細胞，并確定觸發(fā)或阻止它們的基因改變。

“我們的方法不僅提供了一種更有效和更精確的方法來在酵母中進行高通量”功能基因組學“，而不是以前的方法。它還允許我們模擬和測試酵母細胞中微妙的人類基因變異。與某些特征或紊亂松散相關，并找出哪些可能與實際相關，“教授，博士，哈佛醫(yī)學院(HMS)遺傳學教授和哈佛大學健康科學與技術教授麻省理工學院(MIT)。

人類基因的變異通常不會從基因組中完整地刪除它們的序列，而是由小點突變 - DNA代碼中單個A，T，C或G堿基單元的替換組成 - 用于其他一個 - 或插入或刪除一些基本單位。為了在沒有其他潛在干擾變異的情況下在酵母基因組中重建這種變異，該團隊利用CRISPR-Cas9，其可以在小指導RNA(sgRNA)的幫助下精確地靶向DNA中的預選序列。在Cas9酶切割其靶序列后，稱為同源定向重組(HDR)的過程可以通過使用來自另外提供的攜帶感興趣變異的供體模板序列的信息來修復基因。

“我們已經(jīng)開發(fā)出一種策略，將sgRNA和供體模板的藍圖在一個穩(wěn)定且可遺傳的染色體外DNA分子(指導+供體)中進行物理連接。這使我們能夠在一個反應??中構建大型變體文庫，提供多個相應的sgRNA和供體模板集成到酵母細胞，并通過下一代測序識別那些刺激某種細胞行為的模板，“該研究的第一作者之一，博士后研究員肖國國博士說。

在概念驗證研究中，該團隊首先關注編碼DNA解旋酶和修復酶SGS1的單個高度保守基因。然后，他們用毒性試劑廣泛破壞攜帶指導+供體文庫的酵母細胞群的DNA，并對存活細胞的DNA進行測序。這使他們能夠發(fā)現(xiàn)損害SGS1特征的突變，這些特征對于修復受損DNA至關重要，并保證細胞的持續(xù)存活。

接下來，該團隊應用他們的指導+捐贈者策略刪除了一個知之甚少的基因家族的315個成員，這些基因家族編碼所謂的小型開放閱讀框(smORF)，這些框架分散在整個基因組中，一舉一動。通過分析這會如何影響酵母細胞在不同環(huán)境脅迫條件下的存活率，他們可以將以前未知的基本功能分配給特定的smORF，從而為他們的分析打開一個新的門戶。

“除了使用該方法從基因和更大的基因家族中挑出新功能外，一個有趣的潛力還在于研究基因組中的非編碼序列，以促進我們對基因調(diào)控和染色體生物學的理解，”首先說通訊作者Alejandro Chavez博士，博士后，由Church和Wyss Institute核心學院成員James Collins共同指導，現(xiàn)任哥倫比亞大學助理教授。

與該團隊合作的柯林斯博士也是麻省理工學院醫(yī)學工程與科學的Termeer教授和麻省理工學院的生物工程教授。“我們還可以將指導+供體方法用于合成生物學應用，旨在設計具有特定代謝和工業(yè)相關能力的酵母細胞，或將其轉移到病理酵母菌株中，以發(fā)現(xiàn)影響其感染性質(zhì)的基因和基因功能，”他說。

“通過教會和柯林斯實驗室之間的動態(tài)合作而出現(xiàn)的CRISPR-Cas9技術的這一最新應用開啟了另一條途徑，即發(fā)現(xiàn)先前隱藏的分子機制，通過這些分子機制細胞調(diào)節(jié)其生理機能，并且當失調(diào)時，導致感染以及人類疾病，“Wyss研究所創(chuàng)始主任Donald Ingber，醫(yī)學博士，博士，同時也是HMS血管生物學的猶大民俗教授和波士頓兒童醫(yī)院血管生物學項目，以及哈佛大學生物工程教授John A. Paulson工程與應用科學學院。