作為生命的基本單位，每個細胞都含有生物基因組的完整拷貝，隨著細胞的生長和分裂，它可以經(jīng)歷動態(tài)DNA突變。研究單細胞的基因組對于跟蹤數(shù)百或數(shù)千個細胞的全局變化模式非常重要，并將有助于闡明DNA隨時間發(fā)生的變化。除此之外，這將使科學(xué)家能夠深入了解基因組中突變和多樣性的發(fā)展，以及跟蹤與不同疾病的起源和進展相關(guān)的遺傳變化。

在本期Genome Advance中，我們專注于一種新技術(shù)，使研究人員能夠準(zhǔn)確地對單個細胞進行測序。

傳統(tǒng)的全基因組測序技術(shù)使用從大量細胞中提取的DNA來獲得足夠的起始材料用于測序。通過將DNA序列的許多短位(稱為讀段)比對或拼接而獲得正常的共有序列。通過頻率確定基因組每個位置的同一性，使得在每個位置僅出現(xiàn)最常見的堿基對或字母出現(xiàn)在最終序列中。然而，由于可以平均顯著的差異，這種方法忽略了群體中細胞之間的大部分差異。

為了解決這個問題，研究人員一直致力于優(yōu)化可以對單個細胞進行測序的技術(shù)。由于單個細胞只含有少量的DNA，只有幾皮克(皮克數(shù)等于一萬億分之一克)，因此相當(dāng)大的技術(shù)挑戰(zhàn)一直是確定DNA擴增的最佳方法 - 制作多個拷貝DNA - 達到測序所需的足夠量。

現(xiàn)有方法使用非線性或指數(shù)擴增。換句話說，在復(fù)制過程的每個循環(huán)中，從原件復(fù)制的DNA可以作為制作更多拷貝的模板。但是，如果在早期復(fù)制周期中發(fā)生復(fù)制錯誤，或者如果基因組的某些部分比其他部分更有效地擴增，那么這些拷貝將在最終樣本中過量表示。這些技術(shù)，包括多重置換擴增和聚合酶鏈反應(yīng)，通常用于擴增來自單個細胞的DNA用于測序。

這些技術(shù)中固有的偏差可導(dǎo)致整個基因組中測序讀數(shù)的不均勻分布以及最終序列覆蓋的較低百分比的基因組。因此，這些方法通常不夠敏感，無法檢測單核苷酸多態(tài)性(SNPs) - DNA序列單個字母的變異 - 和拷貝數(shù)變異(CNV)等變異 - DNA片段數(shù)量的差異通常被刪除或重復(fù)的。

由哈佛大學(xué)的Xiaoliang Sunney Xie小組教授在2012年12月21日的“科學(xué)”雜志上發(fā)表的一種新的擴增方法減少了這種偏見。這種技術(shù)稱為多重退火和基于環(huán)路的擴增循環(huán)(MALBAC)，采用特殊引物啟動擴增過程，允許以非指數(shù)方式復(fù)制DNA。(引物是與DNA模板結(jié)合的互補DNA分子的短鏈，并作為合成新DNA的起點。)

使用MALBAC提高單細胞測序的準(zhǔn)確性和質(zhì)量代表了基礎(chǔ)科學(xué)和個體化醫(yī)學(xué)的重大進步。這項技術(shù)可以幫助科學(xué)家了解專業(yè)和遺傳上不同的細胞如何協(xié)同作用，形成像大腦網(wǎng)絡(luò)這樣的復(fù)雜系統(tǒng)。當(dāng)只有一個細胞可用于分析時，它對于跟蹤癌癥，篩查產(chǎn)前樣本或測試法醫(yī)標(biāo)本也可能是有價值的。

通過在MALBAC中使用特殊引物，擴增基因組DNA以形成不能作為進一步復(fù)制的模板的環(huán)。由于這些擴增環(huán)的形成，在每個循環(huán)中只能復(fù)制初始基因組DNA，導(dǎo)致原始DNA的近線性擴增。該預(yù)擴增過程減少了現(xiàn)有方法中存在的大量測序偏差。它還促進整個基因組的更均勻復(fù)制，產(chǎn)生序列，其中至少一個序列讀數(shù)覆蓋高達93%的基因組，平均25個讀數(shù)。相比之下，作者發(fā)現(xiàn)用多重置換擴增測序，一種常用于從單細胞擴增DNA的現(xiàn)有方法，在相同條件下僅產(chǎn)生72%的基因組覆蓋率。

使用MALBAC的均一基因組擴增使作者能夠準(zhǔn)確地檢測結(jié)腸癌細胞系中SNP和CNV的產(chǎn)生和積累，這是現(xiàn)有方法無法可靠地進行的。這些數(shù)據(jù)可能對于理解腫瘤進展，跟蹤循環(huán)腫瘤細胞和確定臨床環(huán)境中個體患者的藥物治療反應(yīng)具有意義。

該技術(shù)也可用于測序其他類型的細胞。在與中國北京北京大學(xué)李瑞強教授及其同事合作發(fā)表的一篇配套論文中，作者應(yīng)用MALBAC對來自健康供體的99個精子細胞的基因組進行測序。

與人體其他細胞不同，卵子和精子細胞只含有一組染色體; 精子和卵子的結(jié)合導(dǎo)致受精細胞具有包含人類基因組的正常23對染色體。在染色體分離(分離)并分配到不同細胞之前，通過在每對染色體之間混合DNA的交叉事件將遺傳多樣性引入卵子和精子細胞。在這些交叉事件期間或染色體分離期間產(chǎn)生的異常是出生缺陷和流產(chǎn)的最常見來源，并且還可能與男性不育有關(guān)。

作者發(fā)現(xiàn)甚至在健康供體的精子中也可以發(fā)現(xiàn)諸如SNP和CNV等DNA異常。通過研究單個精子細胞中的SNP，作者能夠以非常高的分辨率繪制交叉事件或染色體分離錯誤的位置。這項研究和其他類似研究對于理解基因組不穩(wěn)定性和生育能力具有重要意義。

新技術(shù)的其他令人興奮的用途包括研究微生物種群的動態(tài)性質(zhì)，例如人類微生物群 - 一群生活在人體內(nèi)部和外部的細菌，真菌，原生動物和病毒，并有助于維持人類健康。(有關(guān)更多信息，請參閱：人類微生物組計劃。)在其他環(huán)境中繁殖的細菌研究將有助于我們探索不同微生物的基因組變異，并可能有助于可再生生物燃料和其他環(huán)境可持續(xù)技術(shù)的開發(fā)。

這只是開始。隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化，科學(xué)家們將能夠?qū)渭毎麥y序應(yīng)用于各種問題，包括各種物種的動態(tài)基因組變異，以及環(huán)境和人類健康。