能源部勞倫斯伯克利國(guó)家實(shí)驗(yàn)室(伯克利實(shí)驗(yàn)室)的研究人員獲得了能夠激發(fā)結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的新成像技術(shù)的又一次成功，獲得了最高分辨率的地圖，其中包含對(duì)DNA有重要意義的大量人類蛋白質(zhì)組合功能。9月13日在“ 自然 ”雜志的高級(jí)在線出版物上報(bào)道他們的成就的科學(xué)家使用低溫電子顯微鏡(cryo-EM)解決了一種叫做轉(zhuǎn)錄因子IIH(TFIIH)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。4.4?；蚪臃直媛?。該蛋白質(zhì)復(fù)合物用于解開DNA雙螺旋，以便在轉(zhuǎn)錄或修復(fù)期間可以訪問和讀取基因。“當(dāng)TFIIH出錯(cuò)時(shí)，DNA修復(fù)不會(huì)發(fā)生，并且這種故障與嚴(yán)重的癌癥傾向，過早衰老和其他各種缺陷有關(guān)，”伯克利實(shí)驗(yàn)室分子生物物理與綜合研究所的主要研究人員Eva Nogales說。生物成像部門“利用這種結(jié)構(gòu)，我們現(xiàn)在可以開始在上下文中放置突變，以更好地理解它們?yōu)槭裁磿?huì)在細(xì)胞中引起不良行為。”

TFIIH在DNA功能中的關(guān)鍵作用使其成為研究的主要目標(biāo)，但它被認(rèn)為是一種難以研究的蛋白質(zhì)復(fù)合物，特別是在人類中。繪制復(fù)雜蛋白質(zhì)所需的先進(jìn)技術(shù)“隨著生物體變得越來(lái)越復(fù)雜，這些蛋白質(zhì)也越來(lái)越復(fù)雜，在許多不同的水平上都需要額外的調(diào)節(jié)功能，”Nogales說，他也是加州大學(xué)伯克利分校和細(xì)胞生物學(xué)教授，也是霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究員。 。“我們從人體細(xì)胞中解析出這種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的事實(shí)使得它與疾病研究更加相關(guān)。沒有必要根據(jù)它在其他生物體中的作用來(lái)推斷蛋白質(zhì)的功能。”

像蛋白質(zhì)這樣的生物分子通常使用X射線晶體學(xué)成像，但該方法需要大量穩(wěn)定的樣品才能使結(jié)晶過程起作用。TFIIH的挑戰(zhàn)在于難以以足夠大的量生產(chǎn)和純化，并且一旦獲得，它可能不會(huì)形成適合于X射線衍射的晶體。

輸入cryo-EM，即使樣本量非常小也可以使用。電子通過在超級(jí)溫度下快速冷凍的純化樣品送出，以防止結(jié)晶冰形成。

Cryo-EM已經(jīng)存在了幾十年，但過去五年的重大進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致這種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)的高分辨率圖像質(zhì)量的巨大飛躍。“當(dāng)你的目標(biāo)是將分辨率降低到幾埃時(shí)，問題在于任何運(yùn)動(dòng)都會(huì)被放大，”研究的主要作者，加州大學(xué)伯克利分校博士后研究員，加州定量生物科學(xué)研究所(QB3)博士后研究員說。“在高放大率下，當(dāng)電子移動(dòng)時(shí)，試樣的輕微移動(dòng)會(huì)導(dǎo)致圖像模糊。”

從單張照片到電影

研究人員將低溫EM的爆炸性增長(zhǎng)歸功于伯克利實(shí)驗(yàn)室工程師Peter Denes幫助開發(fā)的先進(jìn)探測(cè)器技術(shù)。直接探測(cè)器相機(jī)不是為每個(gè)樣本拍攝單張照片，而是在類似于錄制電影的過程中拍攝多個(gè)幀。然后將這些幀放在一起以創(chuàng)建高分辨率圖像。這種方法可以解決樣本移動(dòng)造成的模糊。改進(jìn)的圖像包含更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，并且它們?cè)试S研究人員在多個(gè)狀態(tài)下研究樣本，因?yàn)樗鼈兇嬖谟诩?xì)胞中。

由于拍攝電影所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單幀，并且在顯微鏡檢查期間收集了數(shù)千部電影，研究人員需要在伯克利實(shí)驗(yàn)室的國(guó)家能源研究科學(xué)計(jì)算中心(NERSC)處理超級(jí)計(jì)算機(jī)的處理工作。這些計(jì)算的輸出是一個(gè)需要進(jìn)一步解釋的三維地圖。“當(dāng)我們開始數(shù)據(jù)處理時(shí)，我們有150萬(wàn)個(gè)單個(gè)分子的圖像可以進(jìn)行分類，”格雷伯說。“我們需要選擇代表完整復(fù)合體的顆粒。在NERSC處理300,000小時(shí)后，我們最終得到了120,000張用于計(jì)算蛋白質(zhì)三維圖譜的單個(gè)粒子圖像。”

為了獲得基于這個(gè)三維圖的蛋白質(zhì)復(fù)合物的原子模型，研究人員使用了PHENIX(基于Python的分層環(huán)境用于集成Xtallography)，這是一個(gè)軟件程序，其開發(fā)由伯克利實(shí)驗(yàn)室分子生物物理學(xué)主任Paul Adams領(lǐng)導(dǎo)。綜合生物成像部門和本研究的共同作者。

這種結(jié)構(gòu)不僅有助于對(duì)DNA修復(fù)的基本理解，而且可用于幫助可視化特定分子在藥物開發(fā)中如何與靶蛋白結(jié)合。“在研究這些生物分子的物理和化學(xué)時(shí)，我們經(jīng)常能夠確定它們的作用，但是它們是如何做到的還不清楚，”諾加萊斯說。“這項(xiàng)工作是結(jié)構(gòu)生物學(xué)家所做工作的一個(gè)典型例子。我們建立了理解分子如何運(yùn)作的框架。通過這些信息，研究人員可以開發(fā)出具有更強(qiáng)預(yù)測(cè)能力的精細(xì)靶向療法。”