來自加州大學(xué)舊金山分校和麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的研究所的研究人員已經(jīng)開發(fā)出一種新方法，用于對復(fù)雜的遺傳相互作用進(jìn)行高通量功能篩選，并在單細(xì)胞中產(chǎn)生表型，他們將其稱為“Perturb-seq”。這些發(fā)現(xiàn)可以大大加快科學(xué)家繪制基因相互作用和對環(huán)境刺激的反應(yīng)的能力，從而促進(jìn)對健康基因網(wǎng)絡(luò)的理解以及它們在疾病背景下如何出錯。

在12月15日出版的Cell雜志上發(fā)表了兩篇合著論文，其中一篇由Broad研究所研究人員領(lǐng)導(dǎo)，另一篇由UCSF研究人員領(lǐng)導(dǎo)，Perturb-seq平臺使用單細(xì)胞RNA測序來測量許多基于CRISPR的擾動的影響。在大量的細(xì)胞上。該方法可用于許多實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，例如比以前可能更有效地探索基因組研究中遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子的功能影響，或者觀察癌細(xì)胞中突變的基因。

通過協(xié)作，Broad和UCSF團(tuán)隊(duì)使用Perturb-seq分別對樹突狀細(xì)胞中的免疫反應(yīng)，免疫系統(tǒng)中作為關(guān)鍵信使的細(xì)胞類型以及未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)(細(xì)胞應(yīng)激)進(jìn)行了新的發(fā)現(xiàn)。與許多神經(jīng)退行性疾病有關(guān)的途徑，證明該平臺有可能產(chǎn)生對各種生物學(xué)問題的洞察力。

“在perturb-Seq中，我們將匯集的CRISPR篩選與基于液滴的單細(xì)胞RNA測序的信息豐富的讀數(shù)結(jié)合起來，為我們提供了一個強(qiáng)大的工具，可以顯著增加我們從功能基因組篩選中學(xué)到的關(guān)于電路如何學(xué)習(xí)的范圍廣泛領(lǐng)導(dǎo)的研究的高級作者，麻省理工學(xué)院的生物學(xué)教授，Broad的核心教員，霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究員，Aviv Regev博士說。“特別是，我們可以理解'整體是如何大于其各部分的總和'，也就是說，為什么將兩個不同的基因混合在一起會產(chǎn)生不同于單獨(dú)擾動它們的效果。這將有助于我們更好地預(yù)測當(dāng)我們開發(fā)治療方法時(shí)，我們會以疾病為目標(biāo)。“

“Perturb-seq帶來了兩項(xiàng)技術(shù)進(jìn)步 - 基于CRISPR的擾動和大規(guī)模并行單細(xì)胞RNA測序 - 我們認(rèn)為這將極大地加速我們理解編碼細(xì)胞組分的不同基因如何通常連接在一起的能力加州大學(xué)舊金山分校的細(xì)胞和分子藥理學(xué)教授，霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究員，以及加州大學(xué)舊金山分校領(lǐng)導(dǎo)的研究的高級作者喬納森韋斯曼博士說，這是人類疾病出了什么問題。

還采用了強(qiáng)大的細(xì)胞條形碼策略的設(shè)計(jì)，使研究人員能夠識別事后在合并實(shí)驗(yàn)中對細(xì)胞進(jìn)行的特定擾動，同時(shí)測量這些擾動對細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄物的影響。 。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性處理(例如免疫刺激或細(xì)胞應(yīng)激)后，可以對細(xì)胞進(jìn)行基于液滴的單細(xì)胞RNA測序，以讀出轉(zhuǎn)錄譜和條形碼的同一性。通過索引細(xì)胞的mRNA和條形碼同一性，每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜與傳遞給它的一個或多個遺傳擾動相關(guān)。

“功能基因組學(xué)研究可以揭示基因型和表型之間的聯(lián)系，但我們也想了解兩者之間的機(jī)制關(guān)系，”廣泛領(lǐng)導(dǎo)的研究的共同第一作者，研究生Atray Dixit說。麻省理工學(xué)院。“觀察RNA水平是一個很好的起點(diǎn)。”

在廣泛領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用CRISPR / Cas9核酸酶切割DNA并使參與樹突狀細(xì)胞免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子蛋白(TF)的基因失活，并使癌細(xì)胞系中TF和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的基因失活。 。Perturb-seq準(zhǔn)確地鑒定了受個體基因修飾影響的個體基因靶標(biāo)，基因特征和細(xì)胞狀態(tài)，并探索了這些基因如何相互作用和相互依賴。

“在過去，功能性屏幕必須在測量由許多擾動引起的簡單表型變化之間進(jìn)行選擇，或者在有限數(shù)量的擾動中采用豐富，高分辨率的觀察，”Oren Parnas博士說，他的共同第一作者廣泛領(lǐng)導(dǎo)的研究，曾是Broad研究所的博士后研究員，目前是耶路撒冷希伯來大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究員。“有了Perturb-seq，我們可以在兩端擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)范圍。”

在UCSF主導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用基于CRISPR的轉(zhuǎn)錄干擾(CRISPRi)同時(shí)抑制癌細(xì)胞系中的三個基因并研究未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，這是一種眾所周知的質(zhì)量控制途徑，可以感知壓力在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中，許多細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白質(zhì)被制成。UPR檢測細(xì)胞蛋白質(zhì)生產(chǎn)機(jī)器中的錯誤，并確保受損細(xì)胞自我毀滅。

在全基因組CRISPRi篩選中鑒定出數(shù)百個功能由UPR監(jiān)測的基因后，由UCSF領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用Perturb-seq以單細(xì)胞分辨率查詢這些基因的一個子集，使研究人員能夠系統(tǒng)地揭示這些關(guān)系在基因之間解剖細(xì)胞對ER應(yīng)激反應(yīng)的復(fù)雜方式。

“通過單細(xì)胞RNA測序得到的無偏讀數(shù)，我們可以在沒有事先假設(shè)的情況下發(fā)現(xiàn)有關(guān)生物途徑的信息，”加州大學(xué)舊金山分校領(lǐng)導(dǎo)的研究的共同第一作者，博士后研究員Tom Norman博士說。魏斯曼實(shí)驗(yàn)室 “它開辟了新的可能性，從更有針對性的研究中可能并不明顯。”

Perturb-seq方法可用于研究致病等位基因的功能效應(yīng)，并可大規(guī)模探索可以修改以逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)的其他目標(biāo)。該方法也很有效，因?yàn)樗试S同時(shí)研究幾種擾動，這可以為尋找癌癥中的聯(lián)合療法提供信息。

“通過共同努力建立核心技術(shù)，然后同時(shí)努力評估Perturb-seq和基于CRISPR的方法來滅活或抑制生物學(xué)不同領(lǐng)域的基因，我們的團(tuán)隊(duì)能夠迅速證明該系統(tǒng)具有廣泛的適用性，”加州大學(xué)舊金山分校領(lǐng)導(dǎo)的研究的共同第一作者，Weissman實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員Britt Adamson博士說。“Perturb-seq不僅限于一種類型的CRISPR介導(dǎo)的擾動，這一事實(shí)應(yīng)該令人難以置信，并允許其他研究小組利用這種新方法。”

研究人員表示，他們希望這兩項(xiàng)細(xì)胞研究能夠成為他們新平臺的有力例證，隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的進(jìn)步和未來的強(qiáng)大功能，Perturb-seq可能會變得更加容易和快速，日益強(qiáng)大的研究可以揭示基因及其在健康和疾病中的相互作用。