DNA重復(fù)序列的擴(kuò)增非常難以分析。柏林馬克斯·普朗克分子遺傳學(xué)研究所的研究人員開發(fā)的一種方法可以詳細(xì)查看這些以前無法進(jìn)入的基因組區(qū)域。它結(jié)合了納米孔測序，干細(xì)胞和CRISPR-Cas技術(shù)。該方法可以改善未來各種先天性疾病和癌癥的診斷。

基因組的大部分由單調(diào)區(qū)域組成，其中基因組的短片段重復(fù)數(shù)百或數(shù)千次。但是，這些“ DNA重復(fù)序列”在錯誤位置的擴(kuò)增會產(chǎn)生嚴(yán)重后果，例如對于脆性X綜合征患者來說，這種脆性X綜合征是人類認(rèn)知障礙最常見的遺傳原因之一。但是，這些重復(fù)區(qū)域仍被視為未知領(lǐng)域，即使采用現(xiàn)代方法也無法對其進(jìn)行適當(dāng)檢查。

柏林馬克斯·普朗克分子遺傳研究所的Franz-JosefMüller和基爾的石勒蘇益格-荷爾斯泰因大學(xué)醫(yī)院組成的研究小組最近闡明了這個難以進(jìn)入的基因組區(qū)域。Müller的團(tuán)隊(duì)是第一個成功確定源自患者的干細(xì)胞培養(yǎng)物中基因組串聯(lián)重復(fù)序列長度的團(tuán)隊(duì)。研究人員還通過掃描單個DNA分子獲得了有關(guān)重復(fù)序列表觀遺傳狀態(tài)的數(shù)據(jù)。該方法基于納米孔測序和CRISPR-Cas技術(shù)，為重復(fù)基因組區(qū)域的研究以及對各種疾病的快速準(zhǔn)確診斷打開了大門。

X染色體上的基因缺陷

在脆性X綜合征中，重復(fù)序列已在X染色體上的一個名為FMR1的基因中擴(kuò)展。Müller說：“細(xì)胞識別出重復(fù)區(qū)域，并通過將甲基連接到DNA來關(guān)閉它。” 這些小的化學(xué)變化具有表觀遺傳效應(yīng)，因?yàn)樗鼈兪够A(chǔ)遺傳信息保持完整。Müller解釋說：“不幸的是，表觀遺傳標(biāo)記擴(kuò)散到了整個基因，然后被完全關(guān)閉。” 已知該基因?qū)τ谡５拇竽X發(fā)育至關(guān)重要。他說：“沒有FMR1基因，我們會看到嚴(yán)重的發(fā)育遲緩導(dǎo)致不同程度的智力殘疾或自閉癥。”

在大多數(shù)情況下，女性個體受疾病影響較小，因?yàn)橹貜?fù)區(qū)通常僅位于兩個X染色體之一上。由于未改變的基因的第二個副本沒有在表觀遺傳上發(fā)生改變，因此它能夠彌補(bǔ)遺傳缺陷。相比之下，男性只有一個X染色體和一個受影響基因的副本，并顯示出完整的臨床癥狀。該綜合征是由短串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)展引起的約30種疾病之一。

短串聯(lián)重復(fù)序列的首次精確定位

在這項(xiàng)研究中，Müller和他的團(tuán)隊(duì)研究了源自患者組織的干細(xì)胞的基因組。他們能夠確定重復(fù)區(qū)域的長度及其表觀遺傳特征，這是傳統(tǒng)測序方法無法實(shí)現(xiàn)的。研究人員還發(fā)現(xiàn)，即使在單個患者的細(xì)胞之間，重復(fù)區(qū)域的長度也會有很大的差異。

研究人員還用源自患者的細(xì)胞測試了其過程，該細(xì)胞在C9orf72基因的兩個拷貝之一中包含一個擴(kuò)展的重復(fù)序列。這種突變導(dǎo)致額顳葉癡呆和肌萎縮性側(cè)索硬化的最常見的單基因原因之一。“我們是第一個在單個實(shí)驗(yàn)中繪制延伸和不變重復(fù)區(qū)域的全部表觀遺傳學(xué)的人，”Müller說。此外，DNA分子上的目標(biāo)區(qū)域在物理上保持完全不變。“我們開發(fā)了一種獨(dú)特的方法來分析單個分子和基因組最暗的區(qū)域，這就是讓我如此激動的原因。”

“對于高度重復(fù)的DNA序列，常規(guī)方法受到限制。更不用說無法同時(shí)檢測重復(fù)序列的表觀遺傳特性，”該出版物的第一作者之一比約恩·布朗德爾(BjörnBrändl)說。這就是為什么科學(xué)家使用納米孔測序技術(shù)來分析這些區(qū)域的原因。DNA片段化，每條鏈穿過硅芯片上的一百個小孔(“納米孔”)之一。同時(shí)，帶電粒子流過孔并產(chǎn)生電流。當(dāng)DNA分子穿過這些孔之一時(shí)，電流會根據(jù)DNA的化學(xué)性質(zhì)而變化。電信號的這些波動足以使計(jì)算機(jī)重建遺傳序列和表觀遺傳化學(xué)標(biāo)記。

基因組編輯工具和生物信息學(xué)闡明了“暗物質(zhì)”

常規(guī)測序方法分析患者的整個基因組?，F(xiàn)在，科學(xué)家設(shè)計(jì)了一種選擇性觀察特定區(qū)域的過程。Brändl使用CRISPR-Cas系統(tǒng)從包含重復(fù)區(qū)域的基因組中切割DNA片段。這些片段經(jīng)過幾個中間處理步驟，然后被漏斗到測序芯片的孔中。

生物信息學(xué)家Pay Giesselmann說：“如果我們不以這種方式對分子進(jìn)行預(yù)分選，那么它們的信號將被其余基因組的噪音淹沒。” 他必須開發(fā)一種專門用于解釋重復(fù)序列產(chǎn)生的電信號的算法：“大多數(shù)算法失敗，因?yàn)樗鼈儾黄谕貜?fù)序列的規(guī)則模式。” 盡管吉斯曼的程序“ STRique”不能確定基因序列本身，但它可以高精度地計(jì)算序列重復(fù)的次數(shù)。該程序可從互聯(lián)網(wǎng)上免費(fèi)獲得。

在研究和臨床上有許多潛在的應(yīng)用

“借助CRISPR-Cas系統(tǒng)和我們的算法，我們可以檢查基因組的任何部分，尤其是那些使用傳統(tǒng)方法很難檢查的區(qū)域，”負(fù)責(zé)該項(xiàng)目的Müller說。“我們創(chuàng)造了使每個研究人員都能探索基因組暗物質(zhì)的工具，”穆勒說。他認(rèn)為基礎(chǔ)研究具有巨大潛力。“有證據(jù)表明重復(fù)序列在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中會增長，我們希望對此進(jìn)行仔細(xì)研究。”

醫(yī)師還預(yù)想了在臨床診斷中的許多應(yīng)用。畢竟，重復(fù)區(qū)域參與了癌癥的發(fā)展，新方法相對便宜且快速。Müller決心將手術(shù)提高到一個新水平：“我們非常接近臨床應(yīng)用。”