加州大學(xué)伯克利分校和勞倫斯伯克利國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家發(fā)明了一種合成DNA的新方法，該方法有望更容易，更快，不需要使用有毒化學(xué)品，而且可能更準(zhǔn)確。

該技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性，可以產(chǎn)生比現(xiàn)今方法長(zhǎng)10倍的DNA鏈。研究人員表示，易用性可能導(dǎo)致研究實(shí)驗(yàn)室中無(wú)處不在的“DNA打印機(jī)”，類似于當(dāng)今許多研討會(huì)中的3D打印機(jī)。

加州大學(xué)伯克利分校的研究生Dan Arlow說(shuō)：“如果你是一名機(jī)械工程師，那么在你的商店里安裝一臺(tái)可以在一夜之間打印出一部分的3D打印機(jī)真的很不錯(cuò)，所以你可以在第二天早上進(jìn)行測(cè)試。”“如果你是一名研究人員或生物工程師，并且你有一種簡(jiǎn)化DNA合成的工具，'DNA打印機(jī)'，你可以更快地測(cè)試你的想法并嘗試更多新想法。我認(rèn)為這會(huì)帶來(lái)很多創(chuàng)新。”

Arlow和同事Sebastian Palluk是德國(guó)達(dá)姆施塔特工業(yè)大學(xué)的博士生，也是伯克利實(shí)驗(yàn)室的一名訪問(wèn)學(xué)生，他們?cè)?月18日在線出版并計(jì)劃在7月出版的Nature Biotechnology雜志上發(fā)表他們的新方法。他們和他們的同事在加利福尼亞州埃默里維爾的能源部聯(lián)合生物能源研究所進(jìn)行了這項(xiàng)研究。

“我個(gè)人認(rèn)為丹和塞巴斯蒂安的新方法可以徹底改變我們制造DNA的方式，”加州大學(xué)伯克利分?；瘜W(xué)和生物分子工程教授，伯克利實(shí)驗(yàn)室高級(jí)教員科學(xué)家和JBEI首席執(zhí)行官杰伊凱斯林說(shuō)。

Palluk來(lái)自德國(guó)專門與Arlow一起研究Keasling實(shí)驗(yàn)室的DNA合成問(wèn)題，該實(shí)驗(yàn)室一直是合成生物學(xué)領(lǐng)域的先驅(qū)。Keasling和JBEI科學(xué)家專門為微生物(主要是酵母和細(xì)菌)添加基因，以可持續(xù)的方式生產(chǎn)有用的產(chǎn)品 - 藥物，燃料，工業(yè)化學(xué)品，副產(chǎn)物毒性最低，能耗最低。

“我們相信，增加DNA結(jié)構(gòu)的使用將加速疾病新療法的開(kāi)發(fā)，并簡(jiǎn)化新藥的生產(chǎn)，”Palluk說(shuō)。

40年的合成過(guò)程

合成DNA是一項(xiàng)不斷發(fā)展的業(yè)務(wù)，因?yàn)楣居嗁?gòu)定制基因，因此他們可以在微生物大桶中生產(chǎn)生物藥物，工業(yè)酶或有用的化學(xué)物質(zhì)。研究人員購(gòu)買合成基因以插入植物或動(dòng)物或嘗試新的基于CRISPR的疾病療法。

一些科學(xué)家甚至提出將信息存儲(chǔ)在DNA中，就像今天存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)硬盤中的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)一樣，因?yàn)橐豢薉NA理論上可以存儲(chǔ)相當(dāng)于5000萬(wàn)張DVD并且應(yīng)該穩(wěn)定幾個(gè)世紀(jì)。然而，這意味著合成比目前生物技術(shù)行業(yè)中使用的DNA鏈更多的DNA鏈。

所有這些應(yīng)用都要求合成過(guò)程忠實(shí)地產(chǎn)生所需的核苷酸或堿基序列 - DNA的構(gòu)建塊 - 在數(shù)百萬(wàn)甚至數(shù)十億拷貝的DNA分子中。

目前的DNA合成，其歷史可以追溯到1981年，并且使用來(lái)自有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)，僅限于直接生產(chǎn)約200個(gè)堿基長(zhǎng)的所謂寡核苷酸，因?yàn)殡S著長(zhǎng)度的增加，該過(guò)程中的不可避免的錯(cuò)誤導(dǎo)致正確序列的低產(chǎn)率。為了組裝一個(gè)小基因，科學(xué)家們必須在約200個(gè)堿基長(zhǎng)的片段中逐步合成它，然后將它們縫合在一起。這是耗時(shí)的，通常需要多次嘗試，有時(shí)甚至完全失敗。

此外，當(dāng)從Twist Biosciences Inc.和Integrated DNA Technologies(IDT)等合成公司訂購(gòu)時(shí)，一個(gè)約1,500個(gè)堿基長(zhǎng)的小基因的周轉(zhuǎn)時(shí)間可能是兩周，成本為300美元，限制了研究人員可以進(jìn)行的基因調(diào)整數(shù)量。能夠嘗試和他們可以嘗試的速度。像Keasling，Arlow和Palluk這樣的合成生物學(xué)家經(jīng)常將十幾種不同的基因一次性插入微生物中，使其產(chǎn)生所需的化學(xué)物質(zhì)，每種基因都有其自身的合成問(wèn)題。

“作為德國(guó)的一名學(xué)生，我參加了國(guó)際合成生物學(xué)競(jìng)賽iGEM，在那里我們?cè)噲D讓大腸桿菌細(xì)菌降解塑料廢物。但我很快意識(shí)到，大部分研究時(shí)間都用于獲取所有的DNA一起，沒(méi)有做實(shí)驗(yàn)，看看工程細(xì)胞是否可以分解塑料。這真的促使我研究DNA合成過(guò)程，“Palluk說(shuō)。

化學(xué)DNA合成還需要使用具有毒性的特定類型的活化DNA構(gòu)建塊，以及用石油衍生的溶劑洗滌的重復(fù)循環(huán)。Arlow說(shuō)，廢物處理的問(wèn)題以及由于對(duì)水分極其敏感而使該過(guò)程變得挑剔的事實(shí)是研究人員擺脫他們的個(gè)人寡核苷酸合成器并且現(xiàn)在由專業(yè)公司合成DNA的原因。

攻擊免疫系統(tǒng)

這項(xiàng)新技術(shù)依賴于在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的DNA合成酶，該酶天然具有向水中現(xiàn)有DNA分子添加核苷酸的能力，其中DNA最穩(wěn)定。該技術(shù)有望提高精確度，這可以使DNA鏈的合成時(shí)間延長(zhǎng)10倍，或數(shù)千堿基長(zhǎng) - 中等大小基因的大小。

“我們已經(jīng)想出了一種合成DNA的新方法，它利用了大自然用來(lái)制造DNA的機(jī)器，”Palluk說(shuō)。“這種方法很有前途，因?yàn)槊敢呀?jīng)進(jìn)化了數(shù)百萬(wàn)年才能完成這種精確的化學(xué)反應(yīng)。”

細(xì)胞通常不會(huì)從頭開(kāi)始合成DNA;它們大多是在許多不同的聚合酶的幫助下復(fù)制的，這些聚合酶基于細(xì)胞中已有的DNA模板。然而，在20世紀(jì)60年代，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種不尋常的聚合酶，它不依賴于現(xiàn)有的DNA模板，而是隨機(jī)地將核苷酸添加到制造免疫系統(tǒng)抗體的基因中。這種酶被稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)，在這些基因中產(chǎn)生隨機(jī)變異，因此得到的抗體蛋白能夠更好地靶向前所未見(jiàn)的入侵者。

Paldk說(shuō)，TdT同樣可以很好地添加所有四種DNA核苷酸，沒(méi)有副反應(yīng)可能會(huì)破壞所產(chǎn)生的分子，并且非?？?，如果你讓它自由輪，每分鐘擴(kuò)展DNA大約200個(gè)堿基。

多年來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)室試圖利用這種酶合成所需的DNA序列，但酶很難控制。關(guān)鍵要求是弄清楚如何使酶添加一個(gè)核苷酸然后停止，以便可以一次一個(gè)堿基合成所需的序列。所有先前的提議都試圖通過(guò)使用具有阻止多次添加的特殊阻斷基團(tuán)的修飾核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)該控制。在DNA分子被封閉的核苷酸延伸后，除去封閉基團(tuán)以進(jìn)行下一次添加。

“這些方法與下一代測(cè)序技術(shù)有很多共同之處，”Palluk說(shuō)，指的是用于讀取遺傳序列的最先進(jìn)技術(shù)，它通過(guò)使用模板依賴性聚合酶順序添加阻斷以不同顏色發(fā)熒光的核苷酸，表明添加了四種可能堿基中的哪一種。

雖然用于測(cè)序的DNA復(fù)制酶能夠在添加的核苷酸上容納阻斷基團(tuán)，但TdT不能。當(dāng)核苷酸正確定位用于反應(yīng)時(shí)，其反應(yīng)位點(diǎn)太緊以不適合阻斷基團(tuán)。

Arlow的想法是將未阻斷的核苷酸牢固地連接到TdT，以便在將核苷酸添加到生長(zhǎng)中的DNA分子后，酶保持附著并且自身保護(hù)鏈的末端免于進(jìn)一步添加。在DNA分子延伸后，它們切斷連接系鏈以釋放酶并重新暴露末端以進(jìn)行下一次添加。

在他們的第一次試驗(yàn)中 - 使用工程化TdT酶創(chuàng)建10堿基寡核苷酸的10個(gè)循環(huán) - 伯克利研究人員表明，他們的快速和簡(jiǎn)單技術(shù)在合成的每個(gè)步驟中幾乎與當(dāng)前技術(shù)一樣準(zhǔn)確。

“當(dāng)我們使用NGS分析產(chǎn)品時(shí)，我們能夠確定大約80%的分子具有所需的10堿基序列，”Arlow說(shuō)。“這意味著，平均而言，每一步的收益率都在98%左右，這對(duì)于這個(gè)50多歲的問(wèn)題首次出現(xiàn)并不算太糟糕。我們希望達(dá)到99.9%以便制造基因 - 長(zhǎng)DNA。“

Palluk說(shuō)，一旦它們達(dá)到99.9%的保真度，它們可以一次合成一個(gè)1000堿基長(zhǎng)的分子，產(chǎn)率超過(guò)35%，這在目前的化學(xué)合成技術(shù)中是完全不可能的。

“通過(guò)直接合成較長(zhǎng)的DNA分子，將寡核苷酸縫合在一起的需要以及這一繁瑣過(guò)程產(chǎn)生的局限性可以減少。我們的夢(mèng)想是直接合成基因長(zhǎng)度序列，并在幾天內(nèi)將它們送到研究人員，”他說(shuō)。

“我們的希望是，該技術(shù)將使生物工程師更容易更快地找到如何生產(chǎn)有用產(chǎn)品的生物制造，這可能導(dǎo)致生產(chǎn)我們?cè)谑澜缟弦蕾嚨臇|西的更可持續(xù)的過(guò)程，包括服裝，燃料和食品，以一種需要較少石油的方式，“阿洛說(shuō)。