牛蜱由殺蟲劑控制，總是導(dǎo)致抗性菌株的選擇。在巴西，這種寄生蟲目前對牛農(nóng)使用的所有商業(yè)殺蟲劑或多或少都有抵抗力。最廣泛用于控制牛蜱種群(以及人寄生蟲)的抗寄生蟲藥物是伊維菌素，一種廣譜驅(qū)蟲藥，殺螨劑和殺蟲劑。巴西的商業(yè)牛牛群總額在2017年2.177億的動物，根據(jù)國家農(nóng)業(yè)部。同年，巴西是世界上主要的牛肉出口國，運輸總額達62.8億美元。

如果不是寄生蟲造成巨大的年度經(jīng)濟損失，這些數(shù)字甚至可能更高。據(jù)估計，2014年這一損失至少達到139億美元。換句話說，寄生蟲在死亡率，體重減輕，生育能力受損和產(chǎn)量減少方面造成的損失是年出口值的兩倍多。

最嚴重的損害是由內(nèi)部寄生蟲引起的，例如腸胃蠕蟲，造成損失達71億美元(占總數(shù)的51%)。接下來是外來的寄生蟲，它們生活在牛的皮膚上或者去看它們喂食。沒有比南方牛蜱(Rhipicephalus(Boophilus)microplus)更多的損害，其損失總計32億美元(23.2%)。角蠅(Haematobia irritans)造成損失25億美元(18.3%)，而家蠅(Dermatobia hominis)，螺旋蠅(Cochliomyia hominivorax)和穩(wěn)定蒼蠅(Stomoxys calcitrans)造成的損失達10億美元(7.5%)。

最近在“ 科學(xué)報告 ”上發(fā)表的一篇文章介紹了一項研究，其中巴西研究人員隸屬于圣保羅大學(xué)生物科學(xué)研究所(IB-USP)的遺傳學(xué)和進化生物學(xué)系以及埃爾多拉多的DesidérioFinamor獸醫(yī)研究所(IPVDF)。 Sul(南里奧格蘭德州)確定了牛蜱對伊維菌素的抗性機制，伊維菌素是最常用于對抗R. microplus的藥物之一。

該研究得到了圣保羅研究基金會 - FAPESP和國家科學(xué)和技術(shù)發(fā)展委員會(CNPq)的支持。

“當蜱以動物的血液為食時就會發(fā)生感染，因為它會在唾液中含有抗止血，抗炎和免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的動物接種動物，”Tatiana Teixeira Torres說，他與遺傳學(xué)家ValériaLesLe一起進行了這項研究。 Gall和Guilherme Marcondes Klafke。

根據(jù)托雷斯的說法，這些物質(zhì)可以改變宿主在咬傷周圍的生理機能，導(dǎo)致血液流失，免疫力和刺激性降低。“動物因感染而受到的壓力導(dǎo)致它停止喂食，減肥并變得不那么肥沃，”她說。

“伊維菌素作為一種叫做GABA的神經(jīng)遞質(zhì)的類似物，在脊椎動物和無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)，”托雷斯說。“在牛蜱的情況下，這種神經(jīng)遞質(zhì)通過結(jié)合并激活谷氨酸門控氯離子通道受體起作用，這些受體是無脊椎動物專有的神經(jīng)受體。該藥物在分子水平起作用，與神經(jīng)肌肉接頭處的神經(jīng)元氯離子通道結(jié)合，阻斷神經(jīng)傳遞，使昆蟲的肌肉癱瘓并導(dǎo)致死亡。“

伊維菌素于1975年被發(fā)現(xiàn)，自1981年以來一直在商業(yè)上使用。在牛蜱的情況下，這意味著無數(shù)代的R. microplus已經(jīng)暴露于該藥物超過三十年，足夠長的時間使昆蟲產(chǎn)生抗性。它。

根據(jù)Torres的說法，R。microplus的幾種機制可能與其對伊維菌素的抗性有關(guān)，包括解毒或耐受毒物的生理能力。“解毒的代謝機制是由酶家族和特定蛋白質(zhì)介導(dǎo)的，這些蛋白質(zhì)通過自然選擇機制起到了這種作用，”她說。

缺乏這些酶和蛋白質(zhì)的蜱在伊維菌素存在下死亡，而產(chǎn)生所述物質(zhì)的蜱存活并產(chǎn)生更多的后代，從而形成伊維菌素抗性菌株。

托雷斯解釋說，在物種中介導(dǎo)解毒作用的酶家族包括細胞色素P450，酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)。

“其他蛋白質(zhì)，如ABC轉(zhuǎn)運蛋白，也通過ATP消耗將有毒物質(zhì)運輸?shù)郊毎獠浚瑥亩兄诮舛具^程，”由FAPESP資助的托雷斯說。

致命的生物測定

通過增加細胞色素P450，酯酶，GST和ABC轉(zhuǎn)運蛋白的活性來進行農(nóng)藥解毒在各種節(jié)肢動物群中是眾所周知的，包括牛蜱R. microplus。

“在我們的研究中，我們研究了一種耐受伊維菌素抗性的微小孢子菌菌株的解毒機制，與一種對農(nóng)藥敏感的菌株相比，”托雷斯說。

“我們使用致死時間生物測定法分析兩種菌株中的伊維菌素解毒作用，在阻斷所研究蛋白質(zhì)的酶或轉(zhuǎn)運活性的抑制劑存在下，使伊維菌素的毒性作用占上風(fēng)，從而提高死亡率。”

該研究的目的是鑒定在多藥耐藥牛蜱株中伊維菌素解毒中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。為了測試這些蛋白質(zhì)對耐藥性的影響，研究人員使用了每個蛋白質(zhì)家族的特異性抑制劑，并比較了使用或不使用抑制劑治療伊維菌素所導(dǎo)致的死亡率。

抑制劑是能夠誘導(dǎo)改變以防止解毒活性的物質(zhì)：用于細胞色素P450的硫酸丁醚(PBO)，用于酯酶的S，S-三丁基磷酸三酯(DEF)，用于GST的馬來酸二乙酯(DEM)和環(huán)孢菌素A(CsA)對于ABC運輸商。

在生物測定中使用兩種R. microplus菌株。敏感菌株是Mozo，最初來自烏拉圭，用于診斷拉丁美洲的耐藥性。它保持在IPVDF而不與殺螨劑接觸。

根據(jù)Torres的說法，伊維菌素抗性菌株是Juarez，于2010年在圣保羅州的Jacareí市分離。它最初是從養(yǎng)牛場的雄性牛蜱中收集的，據(jù)報道，伊馬替丁無法控制蜱蟲種群。Juarez是一種多重耐藥菌株，除伊維菌素外，其他殺蟲劑的死亡率較低，如氯氰菊酯，雙甲脒，毒死蜱和氟蟲腈。在IB-USP進行的研究僅限于伊維菌素。

進行兩個單獨的致死生物測定電池。第一個設(shè)計用于測量伊維菌素單獨對易感菌株Mozo和抗性菌株Juarez的致死作用。將大約100-150個蜱幼蟲置于紙包中，將其在含有伊維菌素的溶液中溫育10分鐘。

根據(jù)Torres的說法，當從溶液中取出包裝袋時，通過計算每次樣品中接觸伊維菌素后死亡的幼蟲百分比來測量死亡率。該測量在10分鐘，2小時，3小時，4小時和24小時進行。

“第一批致死時間生物測定的結(jié)果表明，單獨用伊維菌素治療幼蟲的反應(yīng)隨時間變化明顯不同，”托雷斯說。

“暴露4小時后，敏感菌株[Mozo]的所有幼蟲都死亡，而抗性株[Juarez]幼蟲的死亡率僅達到40%。這一比例在暴露后24小時保持不變。殺死敏感菌株未能殺死抗性菌株。“

第二批生物測定法再次使用敏感和抗性菌株，但在這種情況下，致死溶液不僅含有伊維菌素，還含有阻斷解毒酶和轉(zhuǎn)運蛋白作用的四種抑制劑之一。

所有四種抑制劑分別在1.88至30微摩爾(μM)的五種不同濃度下進行測試，目的是在不存在伊維菌素的情況下確定抑制劑的理想(無毒)水平。一旦發(fā)現(xiàn)每種抑制劑的最高非致死劑量，它們分別與伊維菌素一起用于通過抑制來探索蛋白質(zhì)在抗藥性中的作用。

例如，如果酶負責(zé)伊維菌素解毒并導(dǎo)致抗性蜱株的死亡率降低，則其抑制將導(dǎo)致死亡率增加，其可達到與易感菌株的死亡率相似的水平。

研究人員發(fā)現(xiàn)，抑制所有四個蛋白質(zhì)家族都會不同程度地提高死亡率。“我們的研究結(jié)果顯示，ABC轉(zhuǎn)運蛋白在Juarez菌株顯示的抗性中發(fā)揮了最重要的作用，”托雷斯說。“當它們被環(huán)孢菌素A抑制時，其死亡率與敏感菌株中觀察到的死亡率非常相似。使用其他抑制劑[PBO，DEF和DEM]也導(dǎo)致耐藥菌株的死亡率更高，但抑制酶發(fā)揮作用在解毒方面不太重要。“

在用抗性菌株(Juarez)進行致死性生物測定期間，當將幼蟲置于含有12μg的伊維菌素和環(huán)孢菌素A(CsA)的溶液中時獲得了最佳結(jié)果。

抗性幼蟲單獨接觸伊維菌素后，40%在4小時內(nèi)死亡，24小時內(nèi)死亡率相同，而接觸殺蟲劑加CsA導(dǎo)致3小時20分鐘內(nèi)死亡50%，24小時內(nèi)死亡率約100% 。

“有趣的是，當暴露于伊維菌素與CsA結(jié)合時，抗性菌株50%死亡率的致死時間與暴露于單獨使用伊維菌素的Mozo(敏感菌株)50%死亡率的致死時間非常相似，證明幾乎完全逆轉(zhuǎn)Juarez菌株的抗性表型，“托雷斯說。

“與暴露于伊維菌素和CsA組合的菌株相比，24小時后僅暴露于伊維菌素的菌株的死亡率增加60%，證明了CsA的協(xié)同作用。”

該結(jié)果提供了伊維菌素抗性R. microplus中解毒機制作用的證據(jù)，有助于了解伊維菌素抗性表型的分子基礎(chǔ)。

“這些知識可以幫助我們找到應(yīng)對伊維菌素在田間抗藥性的新策略，”托雷斯說。“例如，我們測試的抑制劑或具有類似作用的其他分子可以包含在伊維菌素的商業(yè)配方中。”

研究的蛋白質(zhì)活性的差異可能是由編碼這些蛋白質(zhì)的基因的結(jié)構(gòu)，序列或表達中的易感和抗性菌株之間的差異引起的。作為同一個更廣泛項目的一部分，研究人員現(xiàn)在正在研究編碼序列中對這四個家族的基因的取代，以及它們表達水平的改變。

“這項分析將幫助我們確定基因功能與伊維菌素代謝抗性之間的因果關(guān)系，”托雷斯說。