ELISA法測(cè)定癌胚抗原（CEA）操作規(guī)程

1．檢驗(yàn)?zāi)康?/p>

檢測(cè)血清CEA主要是用于空腔臟器如胃腸道、呼吸道、泌尿道的腫瘤診斷，還可作為手術(shù)

療效、是否轉(zhuǎn)移和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的指標(biāo)；另外在某些良性病變中也會(huì)輕度升高，如酒精性肝病、

膽道疾患等。

2．方法原理

采用ELISA雙抗體夾心法：向抗CEA抗體包被的聚苯乙烯反應(yīng)板微孔內(nèi)加入待檢標(biāo)本，再

加酶標(biāo)記抗CEA抗體，加入酶底物顯，用終止液終止反應(yīng)，測(cè)定吸光度值，測(cè)定光密度，

查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本中CEA含量。

3.性能指標(biāo)

此方法快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度度0.5ng/ml。

4．標(biāo)本收集

4．1標(biāo)本類型：靜脈血或動(dòng)脈血的血清或血漿標(biāo)本均可作為檢測(cè)標(biāo)本（抗凝劑可用肝素鈉、

枸櫞酸鈉、ACD、CPDA-1或EDTA，抗凝劑的質(zhì)量應(yīng)符合化試藥品要求——化學(xué)純或分析

純，使用的比例以廠家推薦為準(zhǔn)）；其他體液如尿液、唾液、精液、羊水、胸水、腹水、

汁等體液可以作為檢測(cè)標(biāo)本，但加熱滅活的血清和血庫(kù)的庫(kù)存血?jiǎng)t不宜作為檢測(cè)標(biāo)本。

4．2標(biāo)本留?。阂钥崭篂橐?，收到標(biāo)本后最好立即離心留取血清或血漿（凝固血應(yīng)待其充

分凝固后收集血清），不能有殘留的紅細(xì)胞、纖維蛋白絲，使用肝素治療的病人宜在肝素治

療前抽血。

4．3標(biāo)本保存：留取的標(biāo)本最好在3小時(shí)內(nèi)檢測(cè)，不能立即檢測(cè)的應(yīng)放置于2-8℃最長(zhǎng)達(dá)

14天（可以含有凝塊但要密閉以防蒸發(fā)），或者-10℃最長(zhǎng)達(dá)14天（不能反復(fù)凍融也不能含

有凝塊和紅細(xì)胞）。

4．4標(biāo)本容器：盛放標(biāo)本的容器必須為潔凈的一次性真空采血管、玻璃試管、一次性的不

同規(guī)格的塑料離心管

4．5標(biāo)本外送：如涉及到需要外送的標(biāo)本，必須以規(guī)定的容器（0.5ml塑料離心管）存放并

密封，并根據(jù)郵寄規(guī)則和要求進(jìn)行包裝，運(yùn)送時(shí)還要放入冰袋（2-8℃）或干冰（-10℃）由

專人運(yùn)送至指定地點(diǎn)指定接收人。

4．6拒收標(biāo)本：凡與4.1-4.5所述內(nèi)容不符的標(biāo)本，檢驗(yàn)人員應(yīng)向臨床或就診者說(shuō)明拒收標(biāo)

本的原因，并提出解決的方案或建議。

5．分析系統(tǒng)

5．1器：為美國(guó)BIO-RAD公司提供的MODEL550型酶標(biāo)儀，儀器校準(zhǔn)請(qǐng)參見(jiàn)儀器

操作規(guī)程。

5．2分析試劑：為鄭州博賽生物技術(shù)研究所提供的配套的CEA試劑盒，規(guī)格為48test/盒，

2-8℃貯存，有效期12個(gè)月；在效期內(nèi)使用試劑。

5．3質(zhì)控試劑：為上為鄭州博賽生物技術(shù)研究所提供的配套的CEA試劑盒中所附帶的陰、

陽(yáng)性對(duì)照，2-8℃貯存，有效期12個(gè)月每月一次質(zhì)控小結(jié)，失控要有記錄及糾正的結(jié)果。

6．操作方法

6．1樣品孔加入待測(cè)血清50μl，每孔加入1滴酶結(jié)合物。

6．2充分混勻，封板，置37℃孵育60分鐘。

6．3手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干。洗

板機(jī)洗板：選擇洗滌5次程序洗板后拍干。

6．4每孔加顯劑A液、B液各1滴，充分混勻，封板，室溫避光反應(yīng)10分鐘。

6．5每孔加2滴終止液終止反應(yīng)。

6．7用酶標(biāo)儀讀數(shù)，數(shù)值取波長(zhǎng)450nm（建議使用雙波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀比，參考波長(zhǎng)630nm），

先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。

7．質(zhì)量控制操作程序

7．1每次實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性、陽(yáng)性各2孔，并設(shè)空白對(duì)照1孔隨常規(guī)標(biāo)本一起檢測(cè)。

7．2質(zhì)控結(jié)果登記到本年度的“免疫室定性檢測(cè)項(xiàng)目室內(nèi)質(zhì)控登記表”。

7．3一旦發(fā)現(xiàn)失控，應(yīng)即時(shí)查找和分析原因，并在該結(jié)果欄作詳細(xì)的批注和記錄解決的過(guò)

程；失控情況處理及原因分析詳見(jiàn)8“失控處理”。

7．4每月進(jìn)行質(zhì)控小結(jié)。并將原始數(shù)據(jù)打印和存盤(pán)留檔。

8．失控處理操作程序

8．1失控情況處理：操作者在分析質(zhì)控結(jié)果時(shí)，如發(fā)現(xiàn)質(zhì)控違背了控制規(guī)則，應(yīng)填寫(xiě)失控

報(bào)告單，上交專業(yè)室主管（組長(zhǎng)），由專業(yè)室主管（組長(zhǎng)）做出是否發(fā)出或重測(cè)與質(zhì)控品相

關(guān)的該批次病人標(biāo)本檢驗(yàn)報(bào)告的決定。

8．2失控原因分析：失控信號(hào)的出現(xiàn)受多種因素的影響，這些因素包括操作上的失誤、試

劑、對(duì)照物的存貯條件改變、儀器維護(hù)不良以及采用的質(zhì)控規(guī)則、控制范圍、一次測(cè)定的質(zhì)

控標(biāo)本數(shù)等等。失控信號(hào)一旦出現(xiàn)就意味著與測(cè)定質(zhì)控品相關(guān)的該批病人標(biāo)本報(bào)告可能作

廢，此時(shí)首先要查明導(dǎo)致失控的原因，是對(duì)照物本身的原因還是對(duì)照物以外的原因。如是對(duì)

照物以外的原因則應(yīng)判為真失控，與對(duì)照物相關(guān)的同批次病人標(biāo)本重新檢測(cè)；如是對(duì)照物本

身的原因，則判為假失控，與對(duì)照物相關(guān)的同批次病人標(biāo)本不必重測(cè)，可以發(fā)出報(bào)告。當(dāng)失

控信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，可以采取以下步驟去尋找原因：

8．2．1立即重測(cè)同一對(duì)照物。此法主要用于查明人為誤差，每一步都應(yīng)該認(rèn)真仔細(xì)的操作，

以查明失控的原因；另外，這一步還可以查出偶然誤差，如是偶然誤差，則重測(cè)的質(zhì)控結(jié)果

應(yīng)在允許范圍（在控），可以認(rèn)為該批次的病人標(biāo)本不必重測(cè)。如仍不在允許范圍則可以進(jìn)

行下一步。

8．2．2新開(kāi)一瓶對(duì)照物，重測(cè)失控項(xiàng)目。如果新開(kāi)的對(duì)照血清結(jié)果正常，那么原來(lái)那瓶對(duì)

照血清可能過(guò)期或在室溫放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而變質(zhì)，或者被污染，此時(shí)可以認(rèn)為該批次病人標(biāo)本

不必重測(cè)。如仍不在允許范圍則可以進(jìn)行下一步。

8．2．3進(jìn)行儀器維護(hù)，重測(cè)失控項(xiàng)目。檢查儀器狀態(tài)，檢查光源是否更換，對(duì)儀器進(jìn)行清

洗維護(hù)，然后再測(cè)質(zhì)控品，如在控，則說(shuō)明是儀器原因，該批次的病人標(biāo)本應(yīng)重測(cè)。如仍不

在允許范圍則可以進(jìn)行下一步。

8．2．4更換另一試劑盒，重測(cè)失控項(xiàng)目。檢查試劑是否過(guò)期或貯存環(huán)境，更換試劑盒重新

檢測(cè)對(duì)照物，如在控則說(shuō)明試劑存在問(wèn)題，該批次病人標(biāo)本應(yīng)重測(cè)。如仍不在允許范圍則可

以進(jìn)行下一步。

8．2．5請(qǐng)專家?guī)椭?。?步都未能得到在控結(jié)果，如果其他同類型檢驗(yàn)項(xiàng)目在控，則需要

聯(lián)系試劑廠家尋求技術(shù)幫助；如果其他同類型項(xiàng)目也失控，則需要與儀器廠家工程師取得聯(lián)

系了。

9．注意事項(xiàng)

9．1從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及待測(cè)標(biāo)本所需微孔反應(yīng)條應(yīng)置37℃平衡

30分鐘后方可使用，余者應(yīng)及時(shí)封存于冰箱中以備后用.在平衡試劑的同時(shí)，待測(cè)標(biāo)本應(yīng)需

置平衡30分鐘后再行測(cè)試。

9．2使用前試劑應(yīng)搖勻，并棄１～２滴后垂直滴加。

9．３封片不能重復(fù)使用。

9．４結(jié)果判斷需在反應(yīng)終止后10分鐘內(nèi)完成。

9．５不同批號(hào)的試劑不能混用。

9．６待測(cè)標(biāo)本不可用NaN3防腐，腐爛如需稀釋標(biāo)本，請(qǐng)用小牛血清稀釋。

9．７本試劑盒應(yīng)視為有傳染性物質(zhì)，請(qǐng)按傳染病實(shí)驗(yàn)室檢查規(guī)程處理。

10．結(jié)果計(jì)算

10．1目測(cè)：若被測(cè)定孔顯淺于或等于5ng/ml對(duì)照孔可判為≤5ng/ml或陰性。

若被測(cè)定孔顯深于5ng/ml淺于20ng/ml可判為>5ng/ml或弱陽(yáng)性。

若被測(cè)定孔顯等于或深于20ng/ml對(duì)照孔可判為≥20ng/ml或陽(yáng)性。

10．2比：測(cè)定孔OD值與對(duì)照孔OD值比較判斷結(jié)果。

11．警告值

11．1當(dāng)測(cè)定管OD值略大于對(duì)照孔OD值時(shí)一般視為低濃度區(qū)或灰區(qū)。

12結(jié)果解釋

12．1若被測(cè)定孔顯淺于或等于5ng/ml對(duì)照孔可判為≤5ng/ml或陰性。

若被測(cè)定孔顯深于5ng/ml淺于20ng/ml可判為>5ng/ml或弱陽(yáng)性。

若被測(cè)定孔顯等于或深于20ng/ml對(duì)照孔可判為≥20ng/ml或陽(yáng)性。

12．2對(duì)處于灰區(qū)或可疑標(biāo)本，應(yīng)重復(fù)檢測(cè)或進(jìn)一步做確證試驗(yàn)。

12．3對(duì)于假陽(yáng)性結(jié)果的原因可能有：血清標(biāo)本中含有顆粒性物質(zhì)（紅細(xì)胞）或纖維蛋白絲、

前一份血清標(biāo)本含有高滴度的CEA使得在加樣時(shí)存在攜帶污染、非特異性反應(yīng)存在。

12．4診斷胃腸道、呼吸道、泌尿道的腫瘤等惡性腫瘤等情況時(shí)，CEA檢測(cè)必須同時(shí)結(jié)合其

他血清標(biāo)志物及病人的臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合判斷。

12．5由于靈敏度的局限性，對(duì)含極低濃度CEA（低于檢測(cè)限）的標(biāo)本不能檢出而出現(xiàn)假陰

性，或感染正處于早期的窗口期。

12．6對(duì)于其他體液標(biāo)本和血庫(kù)庫(kù)存血的檢測(cè)結(jié)果只能作為參考。

12．7對(duì)于反復(fù)凍融的血標(biāo)本或含有顆粒性物質(zhì)的血標(biāo)本應(yīng)離心后再進(jìn)行檢測(cè)。

12．8肝素治療病人的血標(biāo)本可能由于部分凝固而存在潛在的纖維蛋白絲，因此可能產(chǎn)生錯(cuò)

誤的結(jié)果。

13．安全防護(hù)

13．1對(duì)任何一份標(biāo)本（包括質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品及檢測(cè)試劑等）都應(yīng)視其為具有傳染性，操作

人員在工作時(shí)應(yīng)戴膠手套、穿工作服。

13．2一旦發(fā)生標(biāo)本容器劃破手或身體、液體濺進(jìn)眼睛等粘膜處，應(yīng)立即用大量的水沖洗，

同時(shí)向上級(jí)醫(yī)師或科領(lǐng)導(dǎo)報(bào)告，必要時(shí)施以丙種球蛋白預(yù)防。

14．常見(jiàn)的誤差源

14．1儀器原因：儀器的性能、儀器的校準(zhǔn)等。

14．2試劑原因：試劑過(guò)期、定標(biāo)液過(guò)期等。

14．3標(biāo)本原因：標(biāo)本處理、收集不符合要求等。

14．4人為原因：結(jié)果填寫(xiě)錯(cuò)誤等。

15．參考文獻(xiàn)

15．1鄭州博賽生物技術(shù)研究所CEA抗原診斷試劑盒