羅格列酮聯(lián)合雷帕霉素抑制多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖及機(jī)制研究

【摘要】：常染體顯性多囊腎病(ADPKD)是人類最常見(jiàn)的單基因遺傳性腎病,

發(fā)病率在1/400-1／1000,我國(guó)約有150萬(wàn)患者,占終末期腎衰竭病因5%-10%。

ADPKD主要特征表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟出現(xiàn)許多個(gè)進(jìn)行性增大的液性囊泡,最終破壞

腎臟的結(jié)構(gòu)和功能。50%患者在60歲時(shí)會(huì)進(jìn)展至終末期腎衰竭。ADPKD除累及

腎臟外,還引起肝、胰囊腫、心瓣膜病、結(jié)腸憩室和顱內(nèi)動(dòng)脈瘤等腎外病變,是一

種嚴(yán)重危害人類健康的系統(tǒng)性疾病。多年來(lái),腎臟病學(xué)者一直致力于尋找治療多

囊腎病的有效方法,基因治療目前存在許多障礙有待克服,通過(guò)藥物治療延緩腎衰

竭進(jìn)展是目前的主要研究方向。多囊腎病治療需要早期、長(zhǎng)期用藥,因此藥物的

安全性成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。由于ADPKD的分子發(fā)病及調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜,

很多問(wèn)題尚未闡明,因此針對(duì)不同發(fā)病環(huán)節(jié)研發(fā)不同藥物,聯(lián)合用于治療不僅可增

強(qiáng)療效,而且減少不良反應(yīng),將具有潛在的的應(yīng)用前景。噻唑烷二酮類PPARy激

動(dòng)劑,如吡格列酮和羅格列酮等,主要用于糖尿病治療。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),噻唑烷二

酮類PPARy激動(dòng)劑可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。2001年Muto等首先觀察到吡

格列酮可延長(zhǎng)多囊蛋白1基因敲除小鼠(pkdl-/-)的生存期(通常在胎兒期死亡)；我

科先前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),羅格列酮可抑制Han:SPRD大鼠囊腫的進(jìn)展,延長(zhǎng)大鼠生存

期,但其機(jī)制尚未完全闡明。mTOR信號(hào)通路異常激活被認(rèn)為是多囊腎病發(fā)生的

重要機(jī)制,新生血管的形成也可促進(jìn)多囊腎病的進(jìn)展；因此我們探討羅格列酮對(duì)

mTOR信號(hào)通路的作用,研究其對(duì)新生血管形成中起重要作用的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因

子(VEGF)的作用；同時(shí)觀察羅格列酮與mTOR抑制劑雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)延緩

ADPKD進(jìn)展的作用,為治療多囊腎病尋找新的途徑。為此,我們首先研究了羅格

列酮對(duì)多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的作用。多囊腎囊腫

襯里上皮細(xì)胞系(WT9-12)由美國(guó)哈佛大學(xué)周晶教授饋贈(zèng)。培養(yǎng)的WT9-12細(xì)胞給

予不同濃度的羅格列酮培養(yǎng)24、48、72h,采用MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：羅格列酮

明顯抑制WT9-12細(xì)胞的增殖,呈時(shí)間、劑量依賴性。預(yù)72h時(shí),50%抑制率濃度

為100μM。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡,結(jié)果顯示羅格列酮明顯抑制

WT9-12細(xì)胞周期,使細(xì)胞停滯于G0／G1期,G0／G1期細(xì)胞增加30%,與對(duì)照組

比較有差異有顯著性意義(P0.05),其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響不大,羅格列酮濃度高達(dá)

200μM時(shí),僅使細(xì)胞凋亡增加6%。多囊腎病的發(fā)展過(guò)程伴有胰島素生長(zhǎng)因子

1(IGF-1)表達(dá)的增加,我們的研究發(fā)現(xiàn)囊腫襯里上皮細(xì)胞對(duì)IGF-1的刺激反應(yīng)較其

它永生化腎小管上皮細(xì)胞(RCTEC)更為明顯。IGF-150ng/ml可誘導(dǎo)囊腫襯里上皮

細(xì)胞增殖增加20%,而對(duì)RCTEC無(wú)明顯影響。羅格列酮可完全抑制IGF-1誘導(dǎo)的

WT9-12細(xì)胞增殖,該作用在羅格列酮12.5μM時(shí)即表現(xiàn)明顯的抑制作用。說(shuō)明羅

格列酮在有IGF-1作用下對(duì)囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯。mTOR

信號(hào)通路異常激活在多囊腎病發(fā)病及發(fā)展中起重要作用,為多種發(fā)病機(jī)制的共同

環(huán)節(jié),抑制mTOR信號(hào)通路可明顯抑制多囊腎病的進(jìn)展,p70S6K及4E-Bp1是

mTOR兩個(gè)主要下游底物。用不同濃度的羅格列酮作用WT9-12細(xì)胞24h,收集細(xì)

胞,提取總蛋白,采用Westernblot方法檢測(cè)p-mTOR/mTOR及其下游

p-p70S6K/p70S6K、p-4E-Bp1/4E-Bp1。結(jié)果顯示羅格列酮下調(diào)p70S6K磷酸化水

平,呈時(shí)間及劑量依賴性,而對(duì)mTOR及其另一個(gè)下游底物4E-Bp1的磷酸化水平

無(wú)明顯影響。mTOR特異性抑制劑雷帕霉素聯(lián)合羅格列酮抑制p70S6K的磷酸化

作用強(qiáng)于單用羅格列酮,不僅表明羅格列酮是不經(jīng)由mTOR抑制p70S6K的磷酸

化,且雷帕霉素聯(lián)合羅格列酮可對(duì)mTOR信號(hào)通路下游p70S6K的磷酸化抑制有

疊加作用,也為mTOR抑制劑雷帕霉素聯(lián)合羅格列酮治療ADPKD提供理論基礎(chǔ)。

羅格列酮的作用有PPARy依賴和非依賴兩種途徑。為研究羅格列酮對(duì)多囊腎囊

腫襯里上皮細(xì)胞mTOR/p70S6K信號(hào)通路的影響是否通過(guò)PPARy依賴途徑,在給

予PPARy特異性抑制劑GW9662預(yù)孵后再給予羅格列酮發(fā)現(xiàn)：GW9662僅部分

抵消了羅格列酮對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。同樣,在給予GW9662抑制劑后再給予

羅格列酮可抑制羅格列酮對(duì)p-p70S6K的下調(diào)效應(yīng),進(jìn)一步采用siRNA干擾技術(shù),

將PPARysiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染W(wǎng)T9-12細(xì)胞后,采用Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),羅格列酮

仍部分抑制p70S6K的磷酸化,這些結(jié)果表明羅格列酮對(duì)細(xì)胞增殖抑制以及對(duì)

mTOR/p70S6K信號(hào)通路的抑制作用可能部分通過(guò)PPARy依賴性和非依賴性兩

條途徑實(shí)現(xiàn)的。新生血管的形成是腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制,也是多囊腎病進(jìn)

展的主要因素。VEGF在新生血管形成中起著重要作用。低(缺)氧可誘導(dǎo)低氧誘

導(dǎo)因子-1α(HIF1-α)高表達(dá),繼而促進(jìn)VEGF表達(dá)。我們對(duì)多囊腎病模型Han:SPRD

大鼠的觀察發(fā)現(xiàn),在4周齡大鼠腎臟,VEGF表達(dá)已增加,此時(shí)局部缺氧不明

顯,HIF1-α的表達(dá)明顯上調(diào)。但是,TNF-α表達(dá)在早期大鼠腎臟出現(xiàn)增加,表明

VEGF的表達(dá)上調(diào)早于HIF1-α,且與局部的炎癥同步。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),TNF-a

不僅能誘導(dǎo)多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF,其他炎癥因子如LPS也同樣可

誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)；說(shuō)明誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)并不是TNF-α所特有,是炎癥的共有

特征。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還證實(shí)TNF-a并不能誘導(dǎo)HIF1-α的表達(dá),也提示TNF-α對(duì)VEGF

的作用并不通過(guò)HIF1-α。因此,早期抑制炎癥反應(yīng)也可減緩多囊腎病的進(jìn)展。羅

格列酮可下調(diào)囊腫襯里上皮細(xì)胞VEGF的表達(dá),呈劑量依賴性,而且羅格列酮對(duì)

TNFα誘導(dǎo)的VEGF高表達(dá)抑制更明顯,可使其下降到應(yīng)用TNFa前的水平。羅格

列酮長(zhǎng)期用于糖尿病的治療,副作用小,因此適用于多囊腎病的早期治療及長(zhǎng)期治

療?；谝陨辖Y(jié)果,我們聯(lián)合應(yīng)用羅格列酮和雷帕霉素抑制多囊腎病囊腫襯里上

皮細(xì)胞的增殖及VEGF的表達(dá),從而為多囊腎病的治療提供新的方法。我們給予

WT9-12細(xì)胞不同濃度的羅格列酮、雷帕霉素、羅格列酮+雷帕霉素,作用72h,采

用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,計(jì)算聯(lián)合用藥指數(shù)(R值)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

及凋亡,采用realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGFmRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：羅格列酮

和雷帕霉素均能抑制囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程,并且二者聯(lián)合

應(yīng)用有疊加作用,羅格列酮單獨(dú)應(yīng)用對(duì)細(xì)胞凋亡的作用不明顯,但與雷帕霉素聯(lián)合

應(yīng)用可明顯促進(jìn)凋亡,具有協(xié)同效應(yīng)。二者具有協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制可能與羅格列酮

抑制mTOR下游p70S6K的磷酸化,雷帕霉素抑制mTOR活性,雙重阻滯促進(jìn)了細(xì)

胞凋亡。我們采取序貫用藥的方式研究發(fā)現(xiàn)：先用雷帕霉素再序貫應(yīng)用羅格列酮

可增強(qiáng)抑制細(xì)胞增殖的作用,具有明顯的協(xié)同效應(yīng)(R1)。雷帕霉素和羅格列酮可分

別抑制多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)(VEGF表達(dá)下調(diào)30%和18%),但兩

藥聯(lián)合作用細(xì)胞時(shí),二者的作用可明顯加強(qiáng)(VEGF下降54%)。一方面可能與羅格

列酮及雷帕霉素對(duì)mTOR信號(hào)通路的共同作用有關(guān),另一方面,羅格列酮可抑制炎

癥,抑制TNFα的表達(dá),而我們的研究發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)與TNFα有關(guān),因此羅格列

酮也可能通過(guò)下調(diào)TNFα抑制了VEGF的表達(dá),從而通過(guò)多途徑,不同的信號(hào)通路

共同作用,抑制多囊腎病的進(jìn)展。總之,本研究表明噻唑烷二酮類PPARy激動(dòng)劑

羅格列酮可通過(guò)直接抑制mTOR的下游p70S6K的磷酸化而抑制囊腫襯里上皮細(xì)

胞的增殖、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,此作用為PPARy依賴性的。多囊

腎囊腫襯里上皮細(xì)胞較RCTEC對(duì)IGF-1刺激更為敏感,而羅格列酮可完全阻斷

IGF-1所誘導(dǎo)的囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖。羅格列酮可下調(diào)囊腫襯里上皮細(xì)胞

VEGF的表達(dá),從而抑制多囊腎病的血管形成,此作用在有TNFα刺激下更明顯,可

完全抑制TNFα誘導(dǎo)的VEGF上調(diào)。羅格列酮與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用可明顯抑制細(xì)

胞增殖和細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及VEGF表達(dá),二者聯(lián)合應(yīng)用較單藥有明顯的

疊加效應(yīng),而序貫用藥方式,即先用羅格列酮再序貫應(yīng)用雷帕霉素,對(duì)細(xì)胞的增殖

有明顯的協(xié)同效應(yīng)。目前多囊腎病的治療仍是個(gè)難題,我們致力于研究聯(lián)合用藥

及不同聯(lián)合用藥方式對(duì)多囊腎病的作用,期望通過(guò)多種藥物的聯(lián)合應(yīng)用,減少藥物

的副作用,增強(qiáng)療效,將在多囊腎病的治療中有更好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)的不足之

處在于缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持,但這項(xiàng)工作已經(jīng)在進(jìn)行中。

【關(guān)鍵詞】：常染體顯性多囊腎病過(guò)氧化物酶體增生物激活受體羅格列酮

雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)