利用DNA，RNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用，有望檢測(cè)生物標(biāo)記物，診斷疾病和改善癌癥靶向治療。量化這些相互作用對(duì)于理解和控制其生物分子機(jī)制至關(guān)重要。

多角度光散射(MALS)是一種強(qiáng)大的工具，可直接測(cè)量溶液中蛋白質(zhì)，核酸和復(fù)合物的摩爾質(zhì)量，無(wú)需熒光或放射性標(biāo)記。

在這次訪談中，Sophia Kenrick博士與News-Medical Life Sciences討論了兩種互補(bǔ)的光散射技術(shù)，尺寸排阻色譜結(jié)合多角度光散射(MALS)和成分梯度MALS，為分析核酸提供了表征工具。以及核酸和蛋白質(zhì)之間的相互作用。

你能解釋研究蛋白質(zhì) - 核酸相互作用的重要性嗎?

目前開(kāi)發(fā)用于治療多種疾病的生物治療劑基于廣泛的生物聚合物。通常，生物治療劑是工程化抗體，但現(xiàn)在所有種類的生物聚合物都用于生產(chǎn)治療劑。基于DNA和RNA的生物治療劑作為癌癥免疫療法和癌癥疫苗正變得越來(lái)越普遍。

這種治療的功效取決于將RNA遞送至免疫細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)化為腫瘤靶向劑。交付方面對(duì)其功效至關(guān)重要。因此，我們必須了解所使用的生物聚合物的性質(zhì)以及它們?nèi)绾闻c其他生物化合物相互作用，以使它們盡可能有效。因此，生物物理特征是必不可少的。例如，遞送效率可能取決于聚合物與RNA結(jié)合的程度，或者純化過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致單鏈RNA形成您不想要的雙鏈體。

表征核酸與宿主蛋白或其他分子之間的相互作用對(duì)于理解健康和疾病狀態(tài)的潛在生物學(xué)也是至關(guān)重要的。獲取有關(guān)這些分子如何結(jié)合的詳細(xì)信息有助于我們了解結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系，并通知敏感或高親和力生物傳感器的發(fā)展。

如何使用光散射來(lái)表征這種相互作用?

光散射研究可以提供關(guān)于這些復(fù)合物的大小，摩爾質(zhì)量和構(gòu)象的關(guān)鍵信息。可以直接測(cè)量分子的摩爾質(zhì)量和與其結(jié)合配體的相互作用強(qiáng)度，而無(wú)需標(biāo)記或摩爾質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這降低了人工制品的風(fēng)險(xiǎn)。

有幾種方法可以將光散射技術(shù)應(yīng)用于DNA和RNA表征。MALS，動(dòng)態(tài)光散射和電泳光散射都可用于表征物理性質(zhì)，例如尺寸，分子量和電荷。

在案例研究中使用了哪種光散射技術(shù)?

兩個(gè)案例研究都使用多角度光散射或MALS。當(dāng)激光指向溶液時(shí)，大部分光線一直通過(guò)，但是一些光線被溶液中的分子向各個(gè)方向散射。散射光的強(qiáng)度與摩爾質(zhì)量，濃度和折射率增量或dn / dc成比例。因此，通過(guò)測(cè)量光散射強(qiáng)度，您可以直接計(jì)算溶液中這些分子的摩爾質(zhì)量。

同時(shí)在多個(gè)角度測(cè)量光散射。這很重要，因?yàn)樯⑸浣堑淖兓c該分子的大小成正比，可用于確定分子或粒子的半徑，這對(duì)于理解較大的DNA和mRNA分子至關(guān)重要。

第一個(gè)案例研究表明，通過(guò)分析溶液中存在的每種物質(zhì)，使用MALS和尺寸排阻色譜(SEC-MALS)來(lái)表征DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合物。第二個(gè)案例研究使用CG-MALS直接測(cè)量溶液中復(fù)合物的結(jié)合親和力和化學(xué)計(jì)量。

SEC-MALS如何用于生物復(fù)合物的研究?

有時(shí)，即使HPLC或UHPLC分離是理想的，僅基于洗脫時(shí)間估計(jì)的樣品的摩爾質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)品的摩爾質(zhì)量不匹配。當(dāng)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品具有不同的密度和不同的構(gòu)象時(shí)，會(huì)出現(xiàn)這種不匹配。

在SEC-MALS中，來(lái)自HPLC或UHPLC柱的流出物流入U(xiǎn)V檢測(cè)器，我們的多角度光散射檢測(cè)器和折射率(RI)檢測(cè)器。UV或RI檢測(cè)器提供濃度測(cè)量，其與MALS強(qiáng)度數(shù)據(jù)一起用于計(jì)算真實(shí)的摩爾質(zhì)量。MALS測(cè)量還通過(guò)揭示峰在摩爾質(zhì)量方面是否均勻或非均相來(lái)證實(shí)溶液已完全分離。

對(duì)于由兩種不同類型的分子組成的復(fù)合物，這種分析并不那么簡(jiǎn)單。每個(gè)組件具有不同的消光系數(shù)和不同的dn / dc。在這種情況下，我們需要應(yīng)用“蛋白質(zhì)結(jié)合物分析”，其使用所有三種檢測(cè)器直接確定我們復(fù)合物中每種組分的量。

使用UV和RI檢測(cè)器測(cè)量濃度，得到每種組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和摩爾質(zhì)量。該技術(shù)有多種應(yīng)用，例如糖基化或聚乙二醇化蛋白質(zhì)，或用肽或核酸功能化的多糖。甚至可以表征非共價(jià)復(fù)合物，例如與膜蛋白質(zhì)相關(guān)的脂質(zhì)的量，或者在我們的情況下是蛋白質(zhì) - 核酸復(fù)合物。

這在SEC-MALS案例研究中如何應(yīng)用?

SEC-MALS和蛋白質(zhì)結(jié)合物分析方法已應(yīng)用于原型泡沫病毒(PFV)整合酶和病毒DNA的復(fù)合物，稱為intasome。

使用UV和RI同時(shí)獲得的PFV整合酶的消光系數(shù)幾乎是我們基于序列所預(yù)期的一半，但是用RI濃度和UV濃度測(cè)量摩爾質(zhì)量證實(shí)它是正確的。這已經(jīng)是關(guān)于有助于確定摩爾質(zhì)量的復(fù)合物的有用信息。

接下來(lái)，使用光散射，UV和RI信號(hào)計(jì)算色譜圖中每個(gè)點(diǎn)的每個(gè)部分的摩爾質(zhì)量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

這表明蛋白質(zhì)部分約為90%，意味著90%的質(zhì)量是蛋白質(zhì)，約10%是DNA。根據(jù)這些信息，我們得到了整個(gè)復(fù)合體的dn / dc和整個(gè)復(fù)合體的消光系數(shù)。我們用這個(gè)濃度和這個(gè)dn / dc來(lái)計(jì)算摩爾質(zhì)量。總摩爾質(zhì)量為194千道爾頓，因此我們知道蛋白質(zhì)部分是174千道爾頓，DNA部分是約20千道爾頓。這相當(dāng)于整合酶的四聚體和兩條與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相匹配的DNA鏈。

觀察到峰的摩爾質(zhì)量不是恒定的，表明蛋白質(zhì)四聚體的解離可能在分離過(guò)程中發(fā)生或某些物質(zhì)可能不飽和。下一個(gè)案例研究顯示了我們?nèi)绾卧诮鉀Q方案中測(cè)量這些親和力和化學(xué)計(jì)量。

那么CG-MALS與SEC-MALS有何不同?

CG-MALS是一種技術(shù)，可以讓我們測(cè)量溶液中形成的配合物的親和力和化學(xué)計(jì)量。

與之前的案例研究不同，MALS適用于未分級(jí)的樣本。將一系列不同組成的樣品注入光散射和濃度檢測(cè)器中，以便我們可以使用MALS來(lái)確定每種組合物的摩爾質(zhì)量。然后，摩爾質(zhì)量的變化可以與溶液中絡(luò)合物的形成有關(guān)。

通過(guò)這種方式，我們可以評(píng)估單體和二聚體以及二聚體和三聚體之間的自締合和平衡。通過(guò)測(cè)量作為濃度函數(shù)的摩爾質(zhì)量，我們可以確定自締合親和力和化學(xué)計(jì)量。

如果沒(méi)有形成絡(luò)合物，則摩爾質(zhì)量將作為濃度的函數(shù)保持恒定。隨著二聚體和三聚體等復(fù)合物的形成，我們發(fā)現(xiàn)摩爾質(zhì)量隨濃度的增加而增加。使用適當(dāng)?shù)哪Ｐ?，我們可以適應(yīng)這種增加，告訴我們關(guān)聯(lián)的親和力和化學(xué)計(jì)量。

相同的技術(shù)可以應(yīng)用于兩種不同物種之間的相互作用。該組合物僅包括不同濃度的兩種物質(zhì)。我們?cè)诿總€(gè)物種過(guò)量時(shí)進(jìn)行測(cè)量，因此我們可以對(duì)該相互作用的整個(gè)化學(xué)計(jì)量進(jìn)行采樣。

隨著絡(luò)合物的形成，該溶液的摩爾質(zhì)量增加，產(chǎn)生特征曲線。結(jié)合的復(fù)合物越多，相互作用越強(qiáng)。這使得峰值更高且更清晰。

此外，峰的位置告訴我們?nèi)芤旱幕瘜W(xué)計(jì)量。如果物種B具有物種A的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，我們將看到峰摩爾比為1：1的頂點(diǎn)。如果每個(gè)B可以結(jié)合兩個(gè)A分子，我們將看到摩爾比為2：1的最大值，依此類推。

此外，由于CG-MAL技術(shù)直接測(cè)量摩爾質(zhì)量，我們可以分辨出1：1和2：2相互作用之間的差異。它們都會(huì)在同一位置達(dá)到最大值，但我們?nèi)匀豢梢詤^(qū)分，因?yàn)?：2復(fù)合物的摩爾質(zhì)量是兩倍。

在您的第二個(gè)案例研究中使用CG-MALS研究了哪個(gè)復(fù)合體?

CG-MALS用于研究與loxP DNA識(shí)別位點(diǎn)復(fù)合的Cre重組酶。

首先，我們使用Cre的濃度梯度來(lái)測(cè)量單獨(dú)的蛋白質(zhì)的摩爾質(zhì)量并確定它是否自我關(guān)聯(lián)。對(duì)DNA本身進(jìn)行了類似的測(cè)試。對(duì)五種不同濃度的每種分子進(jìn)行MALS測(cè)量。

每個(gè)分子的摩爾質(zhì)量在整個(gè)濃度范圍內(nèi)沒(méi)有增加，表明它們根本不是自締合的。Cre給出恒定摩爾質(zhì)量為39千道爾頓，這與單體一致，并且DNA摩爾質(zhì)量測(cè)量為恒定的23千道爾頓，其也是單體。

然后研究酶和DNA之間的關(guān)聯(lián)。在MALS流動(dòng)池中分析13種不同濃度的蛋白質(zhì)和DNA的混合物。隨著Cre / loxP絡(luò)合物的形成，光散射強(qiáng)度的增加與摩爾質(zhì)量隨時(shí)間的增加成比例。

發(fā)現(xiàn)平衡時(shí)的摩爾質(zhì)量約為110千道爾頓。這立刻告訴我們，化學(xué)計(jì)量比大于1：1，因?yàn)?9加23只是62。

峰值位于2：1結(jié)合比的正確位置，但摩爾質(zhì)量仍然大于這種復(fù)合物的應(yīng)用，表明形成了一些更高級(jí)的結(jié)構(gòu)，而不是標(biāo)準(zhǔn)的1：1或2： 1復(fù)雜。這得到了DNA與蛋白質(zhì)的高比例的曲率的支持，該蛋白質(zhì)未被簡(jiǎn)單的2：1模型捕獲。

摩爾質(zhì)量的測(cè)量表明實(shí)際上存在三種不同的絡(luò)合物。第一個(gè)是與DNA結(jié)合的Cre蛋白，這種第一個(gè)結(jié)合發(fā)生的平衡解離常數(shù)為170納摩爾。

然后第二個(gè)Cre以合作的方式與該復(fù)合物結(jié)合。一旦一種Cre蛋白與DNA結(jié)合，對(duì)第二種Cre蛋白的親和力就會(huì)增加。最后，該Cre-loxP雜四聚體以400納摩爾的親和力二聚化。

單個(gè)CG-MALS實(shí)驗(yàn)探索每種物種僅幾百納摩爾的濃度，因此使我們能夠完全描述這種三步結(jié)合機(jī)制。

沒(méi)有必要在多種濃度方案中工作或假設(shè)這些結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)完全飽和，或者該反應(yīng)的一部分可忽略不計(jì)。只需一次實(shí)驗(yàn)，您就可以獲得完整的表征并測(cè)量所有特征。

您不僅可以獲得親和力和化學(xué)計(jì)量，而且CG-MALS還可以為您提供每種混合物的溶液組成。

您能否簡(jiǎn)要介紹兩個(gè)案例研究?

是的，希望，我還表明光散射，無(wú)論是分餾還是分批模式，都不僅僅適用于蛋白質(zhì)。這些相同的分析對(duì)于DNA和RNA以及用于表征與其他分子復(fù)合的核酸是至關(guān)重要的。

這兩個(gè)案例研究強(qiáng)調(diào)了使用MALS可以獲得的類似蛋白質(zhì)/ DNA系統(tǒng)的兩種不同類型的特征。

具有蛋白質(zhì)綴合物分析的SEC-MALS給出了與其DNA配體結(jié)合的病毒整合酶的絕對(duì)摩爾質(zhì)量和蛋白質(zhì)和DNA部分。這是在沒(méi)有摩爾質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的情況下完成的，并且沒(méi)有假設(shè)化學(xué)計(jì)量學(xué)。

在沒(méi)有色譜的分批模式下CG-MALS允許我們?cè)诙嗖降鞍踪|(zhì)/ DNA相互作用中量化該復(fù)合物的親和力和化學(xué)計(jì)量。相互作用分析不需要標(biāo)記或固定。