幾乎人體中的每一個(gè)細(xì)胞，從心臟細(xì)胞到細(xì)菌吞噬免疫細(xì)胞，都是由被稱為線粒體的專門細(xì)胞器產(chǎn)生的化學(xué)能量驅(qū)動(dòng)的。能量產(chǎn)生過(guò)程會(huì)產(chǎn)生高毒性的廢物，因此，與真正的發(fā)電廠一樣，這些細(xì)胞器需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制和監(jiān)督。

這種生死攸關(guān)的任務(wù)確保了細(xì)胞及其所屬生物的存活。細(xì)胞能夠去除受損線粒體的能力與從癌癥到神經(jīng)退行性疾病 - 特別是帕金森病 - 的病癥有關(guān)，其中耗電的神經(jīng)元非常容易受到有缺陷的線粒體的毒性作用的影響。

在4月19日出版的“分子細(xì)胞”雜志上，哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家們報(bào)告說(shuō)，他們開發(fā)了一種新技術(shù)，以前所未有的定量精度分析細(xì)胞如何通過(guò)細(xì)胞自噬或“自食”系統(tǒng)開始去除有缺陷的線粒體。該方法允許他們首次研究源自干細(xì)胞的人類神經(jīng)元中的這一過(guò)程。

通過(guò)將蛋白質(zhì)景觀的“數(shù)字快照”作為細(xì)胞標(biāo)記受損的線粒體進(jìn)行自噬，研究團(tuán)隊(duì)生成了迄今為止該過(guò)程動(dòng)態(tài)的最清晰圖像，包括蛋白質(zhì)修飾反應(yīng)的絕對(duì)測(cè)量及其豐度和隨時(shí)間的變化。

作者說(shuō)，這些結(jié)果為詳細(xì)研究線粒體損傷，細(xì)胞死亡和疾病之間的聯(lián)系奠定了基礎(chǔ)，并建立了一種技術(shù)方法，可用于揭示許多其他環(huán)境中有缺陷的細(xì)胞通路的機(jī)制。

高級(jí)研究報(bào)告作者J. Wade Harper說(shuō)：“如果有一種針對(duì)這種途徑的藥物以治療帕金森病或其他神經(jīng)退行性疾病為目標(biāo)，我們將需要這種程度的細(xì)節(jié)來(lái)了解候選藥物的工作原理。” ，HMS Bert和Natalie Vallee分子病理學(xué)教授和細(xì)胞生物學(xué)系主任。

用于線粒體質(zhì)量控制的分子報(bào)警系統(tǒng)涉及兩種酶：蛋白激酶PINK1，其用磷酸鹽化學(xué)修飾蛋白質(zhì);和泛素連接酶PARKIN，其用稱為泛素的分子標(biāo)記靶蛋白。

在正常情況下，健康的線粒體在其外表面上攜帶很少的PINK1。然而，當(dāng)受損時(shí)，線粒體會(huì)積累PINK1，將磷酸鹽轉(zhuǎn)移到PARKIN以激活它。

一旦激活，PARKIN將泛素轉(zhuǎn)移到各種不同的蛋白質(zhì)上，在線粒體表面形成“泛素外殼”。當(dāng)達(dá)到一定的泛素閾值時(shí)，觸發(fā)細(xì)胞“自食”機(jī)器的募集，導(dǎo)致線粒體的降解。

PINK1和PARKIN的突變已經(jīng)通過(guò)大量研究與帕金森氏病相關(guān)聯(lián)，帕金森氏病涉及某些神經(jīng)元的死亡和大腦中不正確折疊的蛋白質(zhì)的累積。研究人員在描述PINK1-PARKIN途徑方面取得了很大進(jìn)展，但其許多關(guān)鍵特征仍然知之甚少。

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已知遍在蛋白在氨基酸賴氨酸的特定殘基上標(biāo)記其靶蛋白。然而，這僅發(fā)生在一小部分賴氨酸殘基上，并確切地確定了哪些賴氨酸被修飾以及為什么對(duì)該領(lǐng)域是一個(gè)挑戰(zhàn) - 特別是對(duì)于線粒體表面上的十幾個(gè)PARKIN靶標(biāo)。此外，這些目標(biāo)的豐度尚不清楚，這可能會(huì)影響泛素化過(guò)程。

哈珀實(shí)驗(yàn)室以前與HMS細(xì)胞生物學(xué)教授Steve Gygi合作開展的工作已經(jīng)建立了一些方法，可以檢測(cè)與泛素相關(guān)的蛋白質(zhì)中的單個(gè)賴氨酸殘基。

研究小組在當(dāng)前的研究中擴(kuò)展了這種方法。由主要作者，細(xì)胞生物學(xué)HMS研究員Alban Ordureau帶頭，他們開發(fā)了一種新方法-PAPIN目標(biāo) - 平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Pt-PRM) - 以前所未有的細(xì)節(jié)水平評(píng)估參與線粒體質(zhì)量控制的蛋白質(zhì)泛素化的前景。

他們還創(chuàng)建了一個(gè)參考肽庫(kù)，使他們能夠測(cè)量受損線粒體上PARKIN靶標(biāo)的精確豐度和個(gè)體泛素化事件。

從本質(zhì)上講，參考肽庫(kù)使研究人員能夠在質(zhì)譜儀中同時(shí)以十二種線粒體表面蛋白的位點(diǎn)特異性方式“計(jì)數(shù)”泛素化事件。

當(dāng)與線粒體損傷后的時(shí)間依賴性測(cè)量相結(jié)合時(shí)，該方法產(chǎn)生線粒體表面泛素化事件的“數(shù)字快照”，不僅揭示了修飾的位點(diǎn)特異性，而且還提供了線粒體景觀的定量圖像。

通過(guò)包括檢測(cè)PINK1依賴性磷酸化事件的參考肽，該團(tuán)隊(duì)還能夠?qū)辛姿峄c泛素化相結(jié)合。

“這是迄今為止對(duì)泛素通路進(jìn)行的最詳細(xì)的分析之一。沒有其他研究使用這種復(fù)雜程度來(lái)分析這樣的過(guò)程，”哈珀說(shuō)。

數(shù)碼快照

新技術(shù)允許對(duì)蛋白質(zhì)泛素化事件進(jìn)行準(zhǔn)確，絕對(duì)的測(cè)量，與之前的非定量方法形成鮮明對(duì)比，不提供泛素化 - 位點(diǎn)特異性。

“這種方法現(xiàn)在為我們提供了完整的動(dòng)態(tài)范圍，”哈珀說(shuō)。“我們可以測(cè)量超過(guò)三個(gè)數(shù)量級(jí)，以更好地了解動(dòng)力學(xué)，化學(xué)計(jì)量學(xué)，空間組織，與磷酸化的整合以及許多其他特征，”哈珀說(shuō)。

通過(guò)提高精確度，該團(tuán)隊(duì)對(duì)來(lái)自遺傳修飾的人類干細(xì)胞的神經(jīng)元中的天然泛素化相關(guān)事件進(jìn)行了首次定量分析，該系統(tǒng)與人類疾病研究相比，與以前的模型相關(guān)。

這包括對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的分析，其喪失是帕金森病的主要特征，與哈佛大學(xué)干細(xì)胞和再生生物學(xué)教授李魯賓合作完成。到目前為止，該領(lǐng)域的大多數(shù)研究都是在永生化人類癌細(xì)胞(HeLa)上進(jìn)行的，這些細(xì)胞被設(shè)計(jì)成以非常高的水平表達(dá)PARKIN，以便科學(xué)家們可以測(cè)量它們的活動(dòng)。

Harper，Ordureau及其同事在他們的分析中比較了兩種細(xì)胞模型，確定了修飾事件的特異性和時(shí)間的相似性和差異。他們還在蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)了特異性賴氨酸殘基，這些殘基在神經(jīng)元中被選擇性地泛素化，但在HeLa細(xì)胞中沒有，反之亦然。這組作者說(shuō)，這些差異的生物學(xué)意義仍然未知，并且是進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

這些分析有助于揭示該領(lǐng)域目前存在爭(zhēng)議的問(wèn)題，例如泛素鏈?zhǔn)欠癫患铀妓鞯貥?biāo)記線粒體上的蛋白質(zhì)，或者它們是否精確定位特定的蛋白質(zhì)。

答案可能是“取決于”。一般來(lái)說(shuō)，泛素化似乎隨著蛋白質(zhì)的豐富而擴(kuò)大，但研究人員也發(fā)現(xiàn)了選擇性的證據(jù)，特別是在目標(biāo)蛋白質(zhì)中的某些結(jié)構(gòu)元素內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的穩(wěn)健性還允許作者檢查該途徑的幾個(gè)機(jī)制方面，包括例如確定PINK1在干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元中的PARKIN磷酸化的作用。

“我們想知道這些機(jī)制是如何起作用的，因?yàn)槲覀兿Ｍ軌驅(qū)⑺鼈冏鳛樗幬锇l(fā)現(xiàn)的目標(biāo)，或者找到繞過(guò)病人致病突變的方法，”Ordureau說(shuō)。“我們現(xiàn)在可以非常詳細(xì)地分析神經(jīng)細(xì)胞中的這一關(guān)鍵過(guò)程，并在一次實(shí)驗(yàn)中大規(guī)模地進(jìn)行分析。使用以前的方法，你必須進(jìn)行數(shù)十次實(shí)驗(yàn)才能獲得相似或不太準(zhǔn)確的結(jié)果。”

他們的新方法的功效現(xiàn)在能夠改進(jìn)PINK1-PARKIN途徑的研究及其在帕金森病等疾病中的作用，如PINK1小分子活化劑的研究所證明。作者說(shuō)，該方法還可以用于揭示其他系統(tǒng)和疾病中缺陷通路的機(jī)制。

“泛素化是細(xì)胞用來(lái)去除受損或不需要的成分以保持自身健康和完整性的基本機(jī)制，”哈珀說(shuō)。“它不僅與線粒體有關(guān)，而且與細(xì)菌，蛋白質(zhì)聚集體和其他細(xì)胞器的去除有關(guān)。這項(xiàng)技術(shù)可用于揭示許多不同系統(tǒng)的生物化學(xué)。”