Occidiofungin是由土壤細菌Burkolderia污染物MS14產(chǎn)生的，在結(jié)構(gòu)上與burkholdines、xylocandins和cepacidines相似或相同。本研究鑒定了枕葉ofungin的主要細胞靶點，確定為肌動蛋白。利用功能性烷基修飾枕骨酮，可以進行酵母親和純化和定位研究。枕葉催產(chǎn)素對觸發(fā)細胞凋亡的肌動蛋白動力學(xué)有微妙的影響。我們證明了枕葉苷在酵母中對富含肌動蛋白的細胞區(qū)域的高度特異性定位以及枕葉苷與體外純化肌動蛋白的結(jié)合。此外，還觀察到肌動蛋白介導(dǎo)的細胞過程，如內(nèi)吞、核分離和菌絲形成的破壞。所有這些過程都需要形成穩(wěn)定的肌動蛋白索，這些肌動蛋白索在加入西地芬金亞抑制濃度后被破壞。我們也能夠證明枕葉霉素在小鼠模型中治療外陰陰道酵母菌感染的有效性。本研究的結(jié)果對于開發(fā)有效的新型肌動蛋白結(jié)合藥物具有重要意義，這些藥物可能填補真菌感染或不同類型癌癥治療選擇方面的現(xiàn)有空白。

介紹

由對常用的抗真菌藥物耐藥的病原體引起的真菌感染正變得越來越普遍(1-4)。由非白色念珠菌引起的念珠菌增多和對唑類藥物耐藥性的增加(5-9)令人擔(dān)憂，支持了對新型抗真菌藥物的需求。由于醫(yī)院中存在耐多藥真菌aurda，這一問題預(yù)計將進一步惡化(7)。真菌感染對目前可用的治療方法迅速產(chǎn)生耐藥性的一個例子是外陰陰道念珠菌病(VVC)(10)。VVC將影響約75%的女性，5%至10%的女性將發(fā)展為復(fù)發(fā)性VVC (RVVC)(11-13)。復(fù)發(fā)性VVC幾十年來沒有新的治療進展。

經(jīng)臨床批準(zhǔn)的抗真菌藥物主要由多烯類、棘皮素類和唑類化合物組成。Azoles和polyenes主要作用于麥角甾醇的產(chǎn)生，并分別與麥角甾醇結(jié)合，破壞真菌的細胞膜。棘皮素是由真菌產(chǎn)生的一種天然環(huán)肽化合物合成的脂肽。這一組選擇性地抑制1,3-β-glucan合成功能的非競爭性抑制劑1,3-β-glucan合成酶(14 - 17)。棘皮素和偶氮耐藥真菌病原體的流行以及這些化合物的活性范圍有限是導(dǎo)致需要一種新型抗真菌藥物的主要問題。此外，目前的抗真菌治療導(dǎo)致肝腎功能檢測異常，其活性譜和毒性有限(18,19)。這些局限性和毒性問題使得迫切需要識別具有新作用機制的抗真菌化合物(20)。

Occidiofungin是由土壤細菌Burkholderia污染物MS14(21)產(chǎn)生的一種非核糖體合成的糖脂肽。為環(huán)肽，底質(zhì)量為1200 Da(圖1)(21)。Occidiofungin對絲狀和非絲狀真菌有廣泛的活性，在動物系統(tǒng)中毒性最小(21,22)。我們之前已經(jīng)證明了枕葉霉素的作用機制不同于三種常見的抗真菌藥物的主要作用模式(23,24)。另外的實驗表明，枕葉催產(chǎn)素能在MIC處迅速誘導(dǎo)酵母細胞凋亡(24)。有趣的是，為了觀察到它的殺菌活性，必須有一個臨界濃度的occidiofungin。在亞抑菌濃度下，西方沉淀法對酵母生長速率幾乎沒有影響(23)。用小鼠模型對西地奧芬進行毒理學(xué)初步分析，結(jié)果表明，西地奧芬在10 ~ 20 mg/kg濃度下耐受良好(22)。以5mg /kg的劑量對小鼠靜脈注射枕骨油，誘導(dǎo)毒性最小。多器官的血液化學(xué)分析和組織病理學(xué)表現(xiàn)為短暫的非特異性應(yīng)激反應(yīng)，對器官組織無損傷(25)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，西地芬金作為一種臨床上有用的抗真菌藥物是一種有前途的候選藥物。本報告描述了確定枕葉霉素分子靶點的研究，并確定其在小鼠外陰陰道念珠菌病模型中的療效。

結(jié)果

西地芬尼對臨床相關(guān)真菌的活性譜。由于其獨特的作用機制，西地膚金對耐唑類和棘皮素類真菌具有亞分子活性。對氟康唑和卡泊芬金耐藥的白色念珠菌、透明念珠菌和假絲酵母假體病菌株對枕骨ofungin敏感(見補充材料表S1)。此外，在亞微米濃度下，金葡菌對枕葉苷敏感。耐卡泊芬金治療的念珠菌性錯胞菌和新生C.菌對西地芬金治療敏感。西地芬金也被發(fā)現(xiàn)對皮膚真菌毛癬菌的曲霉菌、毛霉菌、鐮蘇菌、根莖菌以及對唑類和特比那非耐藥菌株具有活性。表S1對結(jié)果進行了總結(jié)，結(jié)果表明，西地芬金對亞微米濃度的絲狀和非絲狀真菌具有活性，其活性譜比其他臨床可用的抗真菌藥物更廣。

西方芳構(gòu)化的烷基衍生物。2 -丁酸殘基的游離氨基在5號位置被酰基化，用末端炔對Occidiofungin進行化學(xué)修飾(圖S1為后續(xù)的click化學(xué)，Sharpless-Huisgen環(huán)加成)。模擬使熒光顯微鏡和結(jié)合研究成為可能。修改occidiofungin alkyne-OF,減少了8倍活動與中等收入國家對釀酒酵母1和0.5µg /毫升BY4741粟酒裂殖酵母972 h -,分別S2(見表)。雙鏈DNA斷裂,生成活性氧(ROS),磷脂酰絲氨酸的外化alkyne-OF-treated細胞觀察,支持本機occidiofungin一樣的作用機制(見圖S2A C)。雖然這炔修改適度降低化合物的抑制活性,功能化導(dǎo)數(shù)具有相同的凋亡的生物活性,因此用來確定真菌的目標(biāo)。

枕葉油細胞內(nèi)定位的體內(nèi)分析。在完整的酵母細胞中進行了枕骨軟骨素定位的體內(nèi)可視化研究。用azide Alexa Fluor 488對pombe進行烷基化和衍生化處理后的時間歷程分析，發(fā)現(xiàn)pombe具有特定的定位模式(圖2a)。烷基- of在處理后10分鐘在極端產(chǎn)生一種微弱的染色模式，隨后在處理后30分鐘強度增加。細胞極端和分裂細胞間隔處可見強熒光。利用釀酒酵母進行的一項類似的實驗顯示，在早期的時間點，烷基- of在芽尖處被定位，隨后在整個母細胞中被染色(圖2b)。形成的獨特圖案是條紋狀和包裹狀結(jié)構(gòu)的組合。在這兩個酵母系統(tǒng)中，當(dāng)細胞在被烷基化- of處理之前，先用本地的occidiofungin預(yù)處理時，觀察到的細胞定位模式消失(圖2a和b，嵌板D, E, F)，這表明烷基化- of和occidiofungin爭奪相同的細胞靶點。在較晚的暴露時間點觀察到的水泡模式表明有肌動蛋白包覆的內(nèi)吞泡在細胞中循環(huán)(26,27)。在生長細胞的細胞尖端和分裂細胞的分裂間隔可見pombe細胞中的肌動蛋白斑塊。肌動蛋白斑塊被招募到分裂的隔膜與肌球蛋白相互作用形成肌動球蛋白環(huán)，在細胞分裂中起作用(28)。這兩種類型的真菌細胞的時間過程分析顯示，枕骨軟骨素定位于已知的肌動蛋白定位的區(qū)域。

西方光化曝光后的光化函數(shù)的攝動。加入occidiofungin對F-actin的聚合或解聚性能無影響(圖S3)。因此，我們進一步研究了肌動蛋白對肌動蛋白功能的干擾，以證實肌動蛋白是occidiofungin的生物學(xué)靶點。白色念珠菌作為一種雙形真菌，可以作為酵母菌或菌絲生長，在這些形式之間轉(zhuǎn)換的能力與機體的致病性有關(guān)(29)。一些報告已經(jīng)證實，肌動蛋白電纜在酵母和菌絲形式之間的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用(30,31)。研究了抗真菌藥物對白色念珠菌細胞形態(tài)開關(guān)的影響。亞抑制濃度的枕骨ofungin孵育后，阻斷了誘導(dǎo)細胞進行形態(tài)轉(zhuǎn)換的菌絲形成(圖3和表S5)。白念珠菌從酵母到絲狀形態(tài)的形態(tài)發(fā)生涉及肌動蛋白動力學(xué)，細胞松弛素A和latrunculin A的處理或肌球蛋白I功能的消除可防止菌絲形成(32,33)。在白念珠菌中，肌動蛋白支架的維持對于細胞內(nèi)吞、DNA分離和細胞分裂也是必要的(34,35)。occidiofungin是否影響其他細胞活動與肌動蛋白動力學(xué),我們評估的影響occidiofungin染色裂殖酵母的細胞內(nèi)吞作用與fm - 464(圖4)。細胞暴露于0.5×麥克風(fēng)和1×麥克風(fēng)證明濃度減少彩色內(nèi)吞作用的囊泡。肌動蛋白也與細胞分裂時有絲分裂紡錘體的正確定位有關(guān)，而缺乏肌動蛋白電纜的突變體表現(xiàn)出多核細胞的聚集(36,37)。暴露后30分鐘內(nèi)，經(jīng)過亞抑制濃度的枕骨油處理的S. cerevisiae和C.白色念珠菌培養(yǎng)物都有更多的雙核細胞，表明經(jīng)母子頸的核運輸中斷或延遲(見表3)。為了進一步闡明肌動蛋白在細胞對枕骨肌動蛋白反應(yīng)中的作用，我們分析了與肌動蛋白聚合和解聚相關(guān)基因缺失的釀酒酵母單倍體突變體。根據(jù)其在肌動蛋白組織和動力學(xué)中的作用，選擇去列坦突變體，并篩選出觀察到的活性的任何偏差(枕ofungin易感性的增加或減少)。測試的18個菌株中,只有Δtpm1變異顯示改變靈敏度occidiofungin,缺失突變體表現(xiàn)出一個4倍耐occidiofungin(見表S4)。tpm1基因是原肌凝蛋白主要亞型的編碼基因，在tpm1基因缺失的情況下，對枕骨ofungin的抗性增加，這可能是由于突變體對細胞應(yīng)激源的耐受性增強(未發(fā)表的數(shù)據(jù))或細胞生長速率下降所致(38)。細胞生長的下降以前被認為與枕葉催產(chǎn)素抵抗有關(guān)(39)。