在一份關于科學進步的新報告中，大韓民國藥理學，電氣與計算機工程，醫(yī)學，納米醫(yī)學和生物信息學系的許權權和跨學科研究人員評估了SpCas9的活性;化膿性鏈球菌的一種細菌RNA引導的Cas9 核酸內(nèi)切酶變體(一種可切割DNA進行基因組編輯的細菌酶)。他們基于人類細胞文庫，使用了具有12,832個目標序列的高通量方法來構建深度學習模型并預測SpCas9的活性。

數(shù)據(jù)包含寡核苷酸(核苷酸或構件)，該寡核苷酸包含靶序列對和相應的指導序列以編碼單指導RNA(sgRNA)，該單指導RNA可以指導Cas9蛋白結合并切割特定的DNA序列以進行基因組編輯。他們在SpCas9誘導的indel (插入或缺失)頻率的大型數(shù)據(jù)集上實施了基于深度學習的訓練，以開發(fā)名為DeepSpCas9的SpCas9活動預測模型，該模型現(xiàn)已在線提供。當團隊針對獨立生成的數(shù)據(jù)集測試該軟件時，結果顯示出較高的泛化性能，即該模型可以適當?shù)剡m應以前看不見的新數(shù)據(jù)。

所述CRISPR-CAS原核適應性免疫系統(tǒng)用作基因組編輯用工具的轉化研究在多種物種和潛在的細胞類型，包括人細胞，其中所述容量準確地預測SpCas9酶的活性是很重要的。研究人員先前已經(jīng)開發(fā)了幾種計算模型，這些模型可以根據(jù)基因編輯細胞的表型變化數(shù)據(jù)集或基于中等大小的質粒數(shù)據(jù)庫(在細菌和其他細胞之間轉移基因的載體)的庫對庫方法來預測SpCas9的活性。。但是，由于數(shù)據(jù)集的質量和大小都不理想，因此這些模型的泛化性能受到限制。例如，模型預測的基因插入和缺失(indels)以創(chuàng)建功能性敲除模型(一種在實驗室中的實驗動物模型中使基因失活的方法)會導致假陰性。此外，這些SpCas9誘導的插入缺失頻率數(shù)據(jù)集也只是中等大小。

Kim等。此前曾報道，一個名為深學習型計算模型DeepCpf1預測不同的核酸內(nèi)切酶(從AsCpf1的活性氨基酸球菌種)具有較高的推廣性能。為此，他們使用了指導RNA編碼的慢病毒文庫，目標序列對來生成稱為DeepCpf1的大型訓練數(shù)據(jù)集。盡管使用類似的基于庫的方法來開發(fā)可預測 Cas9酶產(chǎn)生的插入缺失頻率的計算模型，但仍有大量Cas9誘導的頻率數(shù)據(jù)集尚待形成。

因此，科學家必須開發(fā)具有高泛化性能的Cas9活動預測計算模型。在這項工作中，金等人。通過修改之前開發(fā)的DeepCpf1方法以形成DeepSpCas9，生成了一個高通量模型來測試SpCas9誘導的成千上萬個靶序列的插入缺失頻率。DeepSpCas9 Web工具是基于深度學習的模型，可以以較高的泛化性能準確預測SpCas9的活動。

Kim等。首先準備了一個慢病毒(一個復雜的逆轉錄病毒亞家族，可以整合外源DNA)文庫，包含15656個指導RNA(gRNA)編碼和目標序列對，用于SpCas9活性的高通量評估。該研究小組使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增了包含指導序列和靶序列對的寡核苷酸庫，并使用Gibson DNA組裝技術將它們克隆到慢病毒質粒(用于在細胞之間轉移遺傳物質的轉基因傳遞系統(tǒng))中。

研究人員采用兩步法切割質粒，并在切割位點插入sgRNA支架序列以生成質粒文庫。為了隨后形成細胞文庫，科學家用從質粒文庫產(chǎn)生的慢病毒處理了人類胚胎腎細胞(HEK 293T)?，F(xiàn)在，每個細胞在其基因組中都包含一個合成靶序列，并表達了相應的sgRNA。然后，科學家用編碼SpCas9的慢病毒處理細胞文庫，從而在靶序列上引起sgRNA定向的切割和插入缺失形成，其頻率取決于sgRNA的活性。為了測量插入缺失的頻率，科學家對目標序列進行了PCR擴增，并對其進行了深度測序?；诟咄繉嶒?，Kim等人。生成了兩個數(shù)據(jù)集，用于訓練和測試DeepSpCas9模型。

科學家在具有不同染色質可及性(染色質結構修飾對基因轉錄的影響)的124個內(nèi)源靶位點上選擇了SpCas9活性，以測試整合的合成靶序列的插入缺失頻率是否與相應內(nèi)源位點的插入缺失頻率相關。他們觀察到根深蒂固的靶位點和HEK細胞內(nèi)源性位點的插入缺失頻率之間存在很強的相關性。

研究團隊接下來開發(fā)了一個精確的計算模型，以使用端到端深度學習框架形成DeepSpCas9并預測SpCas9的活動來預測大型數(shù)據(jù)集上的SpCas9的活動。對于基本模型架構，他們使用了卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(CNN，類似于普通神經(jīng)網(wǎng)絡)，對于輸入序列，他們使用了30個核苷酸的序列，并使用一鍵編碼將其轉換為二維二進制矩陣(將包含數(shù)字分類數(shù)據(jù)的列拆分為許多列)。為了了解模型選擇和訓練的通用性能，該團隊使用Spearman相關性進行了10倍交叉驗證 實驗測量值與預測的Cas9活性水平之間的系數(shù)。

當他們增加用于交叉驗證的訓練數(shù)據(jù)集的大小時，實驗indel頻率和DeepSpCas9模型的預測分數(shù)之間的平均Spearman相關系數(shù)穩(wěn)步增加到0.77。與以前用于SpCas9活動預測的傳統(tǒng)機器學習算法(如支持向量機(SVM)，AdaBoost(自適應提升)，隨機森林和梯度增強回歸樹)相比，DeepSpCas9模型的Spearman相關性明顯更高?？傮w而言，DeepSpCas9在所有型號中均表現(xiàn)出最佳性能。

在以前的工作中，Kim等人?？紤]了染色質可及性信息，以改善對內(nèi)源性靶位點AsCpf1酶活性的預測。他們試圖確定這些考慮因素是否還會改善SpCas9的活動預測。結果表明，與他們以前使用AsCpf1所做的努力相比，利用染色質可訪問性信息進行的微調僅能提高DeepSpCas9預測內(nèi)源位點插入缺失頻率的準確性。因此，與先前開發(fā)的DeepCpf1算法形成鮮明對比的是，染色質可訪問性僅對SpCas9活性產(chǎn)生了輕微影響。

為了了解DeepSpCas9的泛化性能，研究小組使用了足夠大的，已發(fā)布的，來自各種研究的數(shù)據(jù)集作為測試數(shù)據(jù)，對該模型進行了測試。他們將結果與其他SpCas9活動預測程序(例如DeepCRISPR)的結果進行了比較。結果表明，在用于預測SpCas9活性的9個已發(fā)布模型中，DeepSpCas9保持最高的泛化功能。這樣，Hui Kwon Kim和研究團隊使用DeepSpCas9網(wǎng)絡工具(現(xiàn)已在線提供，連同補充代碼)廣泛驗證了準確預測SpCas9活動的潛力。提供給研究科學家將DeepSpCas9整合到現(xiàn)有模型中。基于DeepSpCas9的高泛化性能，研究團隊希望能夠提高基于SpCas9的基因組編輯的準確性。