哥倫比亞大學(xué)Vagelos醫(yī)師和外科醫(yī)生學(xué)院的研究人員的一項新發(fā)現(xiàn)可以解決當(dāng)前基因編輯工具(包括CRISPR)的一個主要缺點，并為基因工程和基因治療提供了一種強有力的新方法。

他們的新技術(shù)稱為INTEGRATE，利用細(xì)菌跳躍基因?qū)⑷魏蜠NA序列可靠地插入基因組而不切割DNA。目前的基因編輯工具依賴于切割DNA，但這些切割可能導(dǎo)致錯誤。

“目前的工具就像分子剪刀：他們切割DNA，但實際編輯是由細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)器完成的，”哥倫比亞大學(xué)生物化學(xué)和分子生物物理學(xué)助理教授，新研究的資深作者Sam Sternberg博士說。“你完全可以完成這項工作。”

今天在線發(fā)表在“ 自然 ”雜志上的新INTEGRATE技術(shù)更像分子膠而不是分子剪。

“而不是引入DNA斷裂并依賴細(xì)胞來修復(fù)斷裂，INTEGRATE直接在基因組中的精確位置插入用戶定義的DNA序列，這是分子生物學(xué)家?guī)资陙硪恢睂で蟮哪芰Γ?rdquo;最近Sternberg說道。從加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna實驗室招募到哥倫比亞大學(xué)。

目前的工具很挑剔

使用當(dāng)前工具編輯單元格的基因組就像使用文字處理器編輯一個巨大的文檔，但使用具有自己思想的軟件。通常，研究人員希望在一個特定的DNA堿基序列上做一個小的改變，使基因組的其余部分保持不變。目前最好的工具，使用來自一種細(xì)菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的組件構(gòu)建，以特定序列切割DNA分子的兩條鏈，例如在一段文本中添加段落。

這些中斷只是起點：實際的“編輯”是由細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制完成的，通常使用研究人員提供的DNA序列來填補空白。

依靠細(xì)胞的修復(fù)機(jī)械有很大的局限性。許多細(xì)胞不正確地修復(fù)DNA斷裂或在過程中引入錯誤，并且其他細(xì)胞甚至可能不表達(dá)插入新遺傳有效載荷的必要修復(fù)機(jī)制。此外，DNA斷裂引發(fā)DNA損傷反應(yīng)，可能產(chǎn)生其他不良反應(yīng)。

這使得某些細(xì)胞類型中的基因編輯變得困難或不可能，并嚴(yán)重限制了研究人員以安全的方式引入精確遺傳修飾的能力。

INTEGRATE系統(tǒng)利用跳躍基因

這項新工作通過一個獨立的DNA編輯系統(tǒng)解決了這個問題 - 該系統(tǒng)來自霍亂弧菌 - 不需要細(xì)胞的任何幫助。

CRISPR是一類非常多樣化的細(xì)菌天然防御系統(tǒng)。為了找到新的基因編輯工具，Sternberg和三名研究生尋找細(xì)菌，以尋找經(jīng)過充分研究的CRISPR-Cas系統(tǒng)的變體，這些系統(tǒng)具有不尋常的特性，可以揭示新的工具能力。

這種搜索使它們成為在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子或“跳躍基因”。這種轉(zhuǎn)座子選擇了細(xì)菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)，通常用于阻止移動遺傳元件，將自身插入細(xì)菌基因組的不同區(qū)域。

Sternberg和他的學(xué)生發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子整合到細(xì)菌基因組中的特定位點，而不是通過將DNA切割成兩個，而是通過使用單獨的酶將轉(zhuǎn)座子滑入基因組。重要的是，酶(整合酶)插入DNA的位點完全由其相關(guān)的CRISPR系統(tǒng)控制。

研究人員利用這一發(fā)現(xiàn)創(chuàng)建了一種基因編輯工具，可以編程將任何DNA序列插入細(xì)菌基因組的任何位點。與CRISPR一樣，整合酶通過指導(dǎo)RNA找到合適的位點。

通過重新編程指導(dǎo)RNA，Sternberg和他的學(xué)生能夠精確控制供體DNA整合的位置。通過用其他DNA有效載荷替換轉(zhuǎn)座子序列，它們可以將長達(dá)10,000個堿基的序列插入細(xì)菌基因組中。因此，與其他基于整合的編輯工具不同，INTEGRATE技術(shù)是迄今為止研究的第一個完全可編程的插入系統(tǒng)。

對編輯過的細(xì)菌進(jìn)行測序證實，有效載荷是精確插入的，在非目標(biāo)位置沒有額外的拷貝。

改進(jìn)的基因編輯

使用INTEGRATE，一組酶可以執(zhí)行整個DNA整合過程，可靠地將任意DNA有效負(fù)載插入細(xì)胞基因組內(nèi)的精確位置，而無需依賴宿主細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制。

該技術(shù)應(yīng)該能夠提供廣泛的新基因編輯機(jī)會。許多生物技術(shù)產(chǎn)品，包括基因和細(xì)胞療法，工程化作物和生物制劑，需要精確整合大型遺傳有效載荷。

INTEGRATE技術(shù)提供了一種全新的方法，具有與CRISPR-Cas9相同的可編程性和易用性，但沒有與DNA斷裂相關(guān)的副作用。

“我們可以對這種CRISPR轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行編程，將其遺傳有效載荷整合到幾乎任何基因組位點，通過了解其工作原理，我們將能夠?qū)⑵湓O(shè)計為更有效，”Sternberg說。

下一步

Sternberg的團(tuán)隊使用細(xì)菌遺傳學(xué)實驗開發(fā)了INTEGRATE技術(shù)，現(xiàn)在他們正在測試其他細(xì)胞類型，包括哺乳動物細(xì)胞。

基于CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展軌跡，Sternberg說，有充分的理由相信精確的DNA整合將在哺乳動物細(xì)胞中像在大腸桿菌中一樣有效，為基礎(chǔ)研究用途和最終的臨床應(yīng)用打開了大門。

Sam Sternberg是哥倫比亞大學(xué)Vagelos醫(yī)師和外科醫(yī)生學(xué)院生物化學(xué)和分子生物物理系的助理教授。

Sanne E. Klompe，Phuc LH Vo和Tyler S. Halpin-Healy是哥倫比亞大學(xué)藝術(shù)與科學(xué)研究生院生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的博士生

INTEGRATE代表“通過指導(dǎo)RNA輔助靶向插入轉(zhuǎn)座因子”。

這篇題為“轉(zhuǎn)座子編碼的CRISPR-Cas系統(tǒng)直接RNA指導(dǎo)DNA整合”的論文于6月12日在線發(fā)表在“ 自然 ”雜志上。

該研究得到了哥倫比亞大學(xué)Vagelos醫(yī)師和外科醫(yī)生學(xué)院院長的啟動資金以及哥倫比亞大學(xué)Vagelos精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)基金的試點資助。

哥倫比亞大學(xué)已經(jīng)提交了與此項工作相關(guān)的專利申請，其中SEK和SHS是發(fā)明人。SEK和SHS是與CRISPR-Cas系統(tǒng)及其用途相關(guān)的其他專利和專利申請的發(fā)明人。SHS是Dahlia Biosciences的聯(lián)合創(chuàng)始人和科學(xué)顧問，也是Dahlia Biosciences和Caribou Biosciences的股權(quán)持有人。