由于頭條新聞突出了埃博拉病毒和寨卡病毒的威脅，桑迪亞國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和加州大學(xué)洛杉磯分校(UCLA)的研究人員通過(guò)創(chuàng)建基于CRISPR的篩選庫(kù)(定期聚集在一起)，聯(lián)合發(fā)現(xiàn)和揭示感染的病毒機(jī)制。短回文重復(fù))基因組編輯技術(shù)。

“CRISPR技術(shù)允許研究人員輕易地從宿主細(xì)胞中敲除或去除特定基因，”Sandia研究員Oscar Negrete說(shuō)道，他正在開(kāi)展Sandia項(xiàng)目，開(kāi)發(fā)用于篩選寨卡病毒和其他許多病毒的文庫(kù)。“CRISPR文庫(kù)是為同時(shí)靶向大量基因而構(gòu)建的。”使用這些庫(kù)，研究人員可以快速了解這些基因的去除如何影響病毒感染。通過(guò)CRISPR文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)感染所必需的宿主基因，研究人員可以開(kāi)始使用那些鑒定的基因或基因產(chǎn)物作為靶標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)抗病毒治療。

Negrete與加州大學(xué)洛杉磯分校分子篩選共享資源主任Robert Damoiseaux共同領(lǐng)導(dǎo)該項(xiàng)目。桑迪亞研究人員Joe Schoeniger，Sara Bird和Edwin Saada也正在開(kāi)展為期一年的項(xiàng)目“用于功能基因組學(xué)篩選的Arrayed CRISPR庫(kù)的開(kāi)發(fā)”。這項(xiàng)工作是桑迪亞與加州大學(xué)洛杉磯分校之間首個(gè)合作研究與開(kāi)發(fā)協(xié)議(CRADA)的一部分。

這項(xiàng)工作是在桑迪亞的實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)研究和發(fā)展計(jì)劃下進(jìn)行的，該計(jì)劃投資于高風(fēng)險(xiǎn)，潛在高回報(bào)的科學(xué)，技術(shù)和工程挑戰(zhàn)，具有對(duì)國(guó)家安全產(chǎn)生重大影響的巨大潛力。

“我們的CRADA的目的是使用一種替代的文庫(kù)裝配方法，以標(biāo)準(zhǔn)方法的一小部分成本生成陣列CRISPR文庫(kù)，”Negrete說(shuō)。“通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法相對(duì)昂貴和勞動(dòng)密集型逐個(gè)生產(chǎn)單個(gè)構(gòu)建體，我們將開(kāi)始使用被稱為匯集庫(kù)的CRISPR構(gòu)建體的混合物，其易于生產(chǎn)且成本低廉，然后將混合物分離或排列使用高通量機(jī)器人設(shè)備進(jìn)入單獨(dú)的構(gòu)造。使用新一代測(cè)序，我們可以解碼構(gòu)造以構(gòu)建陣列格式化的庫(kù)。“

“像一罐豆形軟糖一樣，匯集的CRISPR文庫(kù)是一種復(fù)雜的混合物，”Negrete解釋道。“另一方面，陣列庫(kù)更像是單獨(dú)包裝和標(biāo)記的軟糖。當(dāng)您從匯集的屏幕中識(shí)別出感興趣的特定CRISPR時(shí)，您仍然必須運(yùn)行反卷積實(shí)驗(yàn)才能知道您擁有的內(nèi)容。在陣列庫(kù)中，目標(biāo)CRISPR已被標(biāo)記，因此命中識(shí)別更容易，更快，更便宜。“

研究人員的目標(biāo)是生成一個(gè)基因組規(guī)模的陣列CRISPR文庫(kù)，但最初將專注于建立一個(gè)子庫(kù)，該子庫(kù)針對(duì)參與細(xì)胞通訊的膜蛋白，并作為病原體進(jìn)入的受體。

陣列庫(kù)可加速發(fā)現(xiàn)

CRISPR作為細(xì)菌防御系統(tǒng)在自然界中進(jìn)化，現(xiàn)在作為強(qiáng)大的基因組編輯技術(shù)的基礎(chǔ)。與其他基因編輯方法不同，CRISPR便宜，快速且易于使用。Negrete表示，CRISPR已經(jīng)創(chuàng)造了一項(xiàng)生物技術(shù)革命，類似于發(fā)現(xiàn)用于制造數(shù)百萬(wàn)拷貝DNA片段的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)。

“這項(xiàng)技術(shù)正在將醫(yī)學(xué)推向一個(gè)全新的方向，研究人員正試圖治愈任何具有遺傳成分的疾病，”Negrete說(shuō)。“使用CRISPR，理論上可以修改包括人類基因組在內(nèi)的任何基因組。有朝一日它可以治愈任何數(shù)量的遺傳性疾病。”

該CRADA工作將使用高通量篩選和測(cè)序方法開(kāi)發(fā)針對(duì)陣列文庫(kù)的有效途徑。

“作為一種研究工具，CRISPR是功能基因組篩選的理想基因組工程系統(tǒng)，”Negrete說(shuō)。“基于CRISPR的遺傳篩選對(duì)于研究潛在遺傳原因尚不清楚的疾病或表型特別有用。”

在CRISPR之前，科學(xué)家們嚴(yán)重依賴基于RNA干擾的遺傳篩選，這種篩選很容易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，并可能因靶基因的不完全敲除而導(dǎo)致假陰性。CRISPR系統(tǒng)可以在靶基因中進(jìn)行高度特異性的永久性遺傳修飾，并且已經(jīng)用于篩選調(diào)節(jié)疾病相關(guān)表型的新基因。

使用CRISPR進(jìn)行全基因組篩選的最常用方法涉及使用“合并”文庫(kù)。匯集的CRISPR文庫(kù)是數(shù)千種獨(dú)特序列的復(fù)雜混合物，然后將其整批遞送至單組細(xì)胞以篩選疾病表型。由于文庫(kù)是批量遞送的，因此表型分析是有限的。相比之下，陣列的CRISPR文庫(kù)在多孔板中產(chǎn)生，其中每個(gè)孔含有靶向單個(gè)基因的載體制備物。使用這種類型的文庫(kù)，可以探索由大量不同的細(xì)胞擾動(dòng)引起的復(fù)雜表型。此外，陣列庫(kù)提供對(duì)快速輔助后續(xù)屏幕的訪問(wèn)。

即用型庫(kù)

將根據(jù)具體情況向更廣泛的科學(xué)受眾提供對(duì)這種新型CRISPR文庫(kù)的篩選。桑迪亞還計(jì)劃使用這些文庫(kù)篩選病毒機(jī)制和藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)。

該分子篩選共享資源(MSSR)提供的高通量篩選服務(wù)，包括化學(xué)基因組學(xué)，功能基因組學(xué)和藥物研發(fā)的綜合范圍。MSSR是一個(gè)開(kāi)放的環(huán)境，歡迎來(lái)自加州大學(xué)洛杉磯分校和全球各地的學(xué)術(shù)研究人員。

“這只是這種技術(shù)應(yīng)用的開(kāi)始，”Negrete說(shuō)。“如果我們能夠?qū)Π２├《竞驼ú《井a(chǎn)生影響，那么我們就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)。”