新興的單細(xì)胞診斷依賴于快速有效地從復(fù)雜的生物基質(zhì)中分離細(xì)菌的潛力。最近發(fā)表在Microsystems和Nanoengineering上的一項(xiàng)研究，Jung Y. Han及其同事在美國(guó)機(jī)械工程，化學(xué)生物分子工程和生物工程學(xué)院的跨學(xué)科系統(tǒng)開發(fā)了一種裝置，使用微流體多孔二氧化硅整料從全血中分離出完整和存活的細(xì)菌。它們實(shí)現(xiàn)了機(jī)械溶血，同時(shí)通過(guò)整料提供完整和存活的細(xì)菌，用于基于大小的細(xì)菌分離和選擇性裂解。韓等人。描述了合成大量離散的毛細(xì)管結(jié)合的整體元件和毫米級(jí)整體磚以整合到微流體芯片中的方法。

他們探討了整體形態(tài)，幾何形狀和流動(dòng)條件對(duì)細(xì)胞裂解和流動(dòng)狀態(tài)的影響，這些細(xì)胞裂解和流動(dòng)狀態(tài)允許選擇性細(xì)胞裂解和多克革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的選擇性傳代。Han等人采用的技術(shù)。當(dāng)與單細(xì)胞拉曼光譜法結(jié)合時(shí)，允許快速樣品制備和細(xì)菌分析。這項(xiàng)工作提供了獨(dú)特的樣品制備步驟，以支持在應(yīng)用程序的快速和免費(fèi)培養(yǎng)細(xì)菌分析定點(diǎn)護(hù)理生物醫(yī)學(xué)設(shè)備。

血液中的細(xì)菌可導(dǎo)致敗血癥，組織感染和其他嚴(yán)重的疾病，需要及早發(fā)現(xiàn)血源性細(xì)菌進(jìn)行有效治療。使用即時(shí)診斷快速鑒定細(xì)菌的能力可以極大地增強(qiáng)早期感染期間最佳治療的臨床潛力。用于細(xì)菌表征的現(xiàn)有金標(biāo)準(zhǔn)基于表型細(xì)胞培養(yǎng)分析，并且需要至少24小時(shí)來(lái)收集樣品用于在診斷和臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)和分析。現(xiàn)有技術(shù)穩(wěn)健且價(jià)格低廉，但不能產(chǎn)生及時(shí)的結(jié)果來(lái)指導(dǎo)治療的初始階段。

在目前的工作中，Han等人。探索了與多孔硅膠整體結(jié)合的微流體裝置，作為簡(jiǎn)單的流通元件，用于選擇性血細(xì)胞分析和細(xì)菌的完整分離。整料是高度多孔的材料，由開孔形態(tài)組成，具有扭曲的流體流動(dòng)路徑?？茖W(xué)家可以通過(guò)細(xì)胞灌注過(guò)程中的高機(jī)械表面應(yīng)力來(lái)控制整體孔隙形態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞的機(jī)械溶血，同時(shí)允許完整和有活力的細(xì)菌通過(guò)蜿蜒的流動(dòng)路徑進(jìn)行無(wú)培養(yǎng)分離。韓等人。盡管存在細(xì)菌菌株的差異，但在流動(dòng)條件下對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌種使用全血中細(xì)菌的選擇性傳代方法。高通量選擇性整體溶解技術(shù)與強(qiáng)大的分析方法(如拉曼光譜)相結(jié)合，可以在單細(xì)胞水平上對(duì)全血中的細(xì)菌進(jìn)行無(wú)培養(yǎng)分析。

DLS測(cè)量(a)初始25倍稀釋的血液，化學(xué)裂解的血液和通過(guò)整體裝置灌注裂解的血液，顯示機(jī)械整體溶解的細(xì)胞碎片大小顯著減少而不是化學(xué)裂解。(b)懸浮在1×PBS中的陰溝腸桿菌的DLS測(cè)量，以及通過(guò)整體裝置灌注的樣品，顯示細(xì)菌大小沒(méi)有變化。(c)對(duì)摻有陰溝腸桿菌的100×稀釋血液的DLS測(cè)量，以及從多孔整料的出口收集的樣品。入口樣品中的寬峰表示混合的血細(xì)胞和小細(xì)菌細(xì)胞群，而出口樣品顯示大的(>2μm)細(xì)胞顯著減少，如光學(xué)圖像中所證實(shí)的。比例尺=25μm。改進(jìn)先前報(bào)道的二氧化硅整料合成方法，然后在低溫下水解和縮合二氧化硅以形成二氧化硅玻璃。為了制備二氧化硅整料，科學(xué)家使用由烷基硅酸鹽，聚乙二醇(PEG)作為致孔劑，尿素作為羥基離子源的前體溶液，以最小化異質(zhì)性和乙酸。當(dāng)他們優(yōu)化合成過(guò)程時(shí)，得到的整料是均勻的并且良好地錨定在二氧化硅毛細(xì)管壁上?？茖W(xué)家測(cè)量了最終骨架整體結(jié)構(gòu)的厚度，并使用高效液相色譜計(jì)算了其滲透性控制實(shí)驗(yàn)條件。為了盡量減少內(nèi)在變異，Han等人。將得到的毛細(xì)管切成5厘米長(zhǎng)的段，以便在使用前測(cè)試滲透性。

然后，他們開發(fā)了兩種互補(bǔ)的低通量和高通量操作方法，將二氧化硅整料結(jié)合到微流體系統(tǒng)中。為了實(shí)現(xiàn)低通量操作，科學(xué)家在熱塑性微流體芯片中嵌入含有整塊的毛細(xì)管段，以在整合過(guò)程中保護(hù)整體結(jié)構(gòu)。對(duì)于高通量選擇性裂解，它們使用在微流體裝置內(nèi)具有較大橫截面積的整料。完整的制造方法為全血灌注期間的無(wú)泄漏操作提供了極好的可靠性。

作為原理證明，Han等人。選擇陰溝腸桿菌(革蘭氏陰性，桿狀細(xì)菌)來(lái)探討其傳代效果，以及三種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌; 乳酸乳球菌，藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌。在實(shí)驗(yàn)期間，他們通過(guò)具有不同幾何形狀和流動(dòng)條件的微流體整料灌注細(xì)菌溶液，以使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)試細(xì)菌通過(guò)和血細(xì)胞裂解。例如，通過(guò)整料灌注純化的陰溝腸桿菌不會(huì)在DLS峰中產(chǎn)生可辨別的變化，表明細(xì)菌完整傳代。

科學(xué)家們展示了多孔整體裝置長(zhǎng)度對(duì)紅細(xì)胞裂解(RBC)效率的影響。結(jié)果表明，對(duì)于1mm以上的整體長(zhǎng)度，RBC裂解效率顯著增加。韓等人。還研究了整體裝置操作期間白細(xì)胞(WBC)的命運(yùn)，細(xì)胞不能通過(guò)整塊而不像RBC那樣被溶解。從技術(shù)上講，紅細(xì)胞變形為盤狀，通過(guò)整塊，導(dǎo)致膜張力顯著增加，導(dǎo)致RBC溶解。相比之下，細(xì)菌細(xì)胞具有與整體孔相似的尺寸，因此需要較少的細(xì)胞壁膨脹以成功通過(guò)而不會(huì)破裂?？茖W(xué)家們針對(duì)不同的細(xì)菌優(yōu)化了設(shè)備的參數(shù)，以承受高水平的膜應(yīng)力而不會(huì)破裂。進(jìn)一步的發(fā)展確保了細(xì)菌的完整通過(guò)而沒(méi)有降解和生存能力。

對(duì)于高通量細(xì)菌傳代，科學(xué)家們稀釋了毛細(xì)血管裝置中的血液。然而，作為替代方案，它們還可以擴(kuò)展單塊體的全血裂解能力。該裝置處理超過(guò)400μL摻入細(xì)菌的全血，然后由于細(xì)胞裂解導(dǎo)致的堵塞以及由于多孔基質(zhì)內(nèi)捕獲的完整白細(xì)胞(WBC)而顯示出背壓的顯著增加。

為了找到目標(biāo)細(xì)菌，Han等人。在通過(guò)整體工藝之后，獲得沉積在載玻片上的樣品。他們通過(guò)手動(dòng)掃描樣品上的光學(xué)探針進(jìn)行單細(xì)胞拉曼分析。他們期望使用選擇性裂解技術(shù)，與未來(lái)的共焦拉曼顯微鏡相結(jié)合，以改善在確定的感興趣位置以低濃度檢測(cè)感興趣的細(xì)菌菌株的過(guò)程。

通過(guò)這種方式，Jung Y. Han及其同事開發(fā)了一種微流體整料，可有效地分離出完整的細(xì)菌，具有廣泛的治療診斷，臨床應(yīng)用潛力。他們?cè)O(shè)想了共聚焦拉曼顯微鏡工具的結(jié)合，這些工具目前主要局限于研究實(shí)驗(yàn)室，新興的小型化和手持式系統(tǒng)為快速便攜的床邊護(hù)理設(shè)備鋪平了道路。