Salk研究人員已經(jīng)繪制了具有最高分辨率的轉(zhuǎn)基因植物系的基因組和表觀基因組，以準(zhǔn)確揭示插入一片外源DNA時(shí)在分子水平上發(fā)生的情況。他們的研究結(jié)果發(fā)表在2019年1月15日的PLOS Genetics雜志上，闡明了用于修飾植物的常規(guī)方法，并提供了更有效地減少潛在脫靶效應(yīng)的新方法。

“這真的是一個(gè)起點(diǎn)，表明可以使用最新的測繪和測序技術(shù)來研究將基因插入植物基因組的影響，”霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員Joseph Ecker說，他是Salk植物分子學(xué)教授細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和基因組分析實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人。

當(dāng)一個(gè)科學(xué)家想要將一種新基因植入植物中 - 用于基礎(chǔ)研究目的或增加食物作物的健康或營養(yǎng)時(shí) - 他們通常依靠根癌農(nóng)桿菌來完成工作。土壤桿菌是引起冠癭腫瘤的細(xì)菌，樹干上有大的凸起。幾十年前，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌感染樹木時(shí)，它會(huì)將一些DNA轉(zhuǎn)移到樹的基因組中。從那以后，研究人員為了自己的目的選擇了土壤桿菌的這種轉(zhuǎn)移能力，利用其轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)將所需基因轉(zhuǎn)移到植物中。

最近，DNA測序技術(shù)開始暗示當(dāng)農(nóng)桿菌 T-DNA用于將新基因插入植物中時(shí)，它可能導(dǎo)致天然DNA的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的額外變化。

“生物技術(shù)公司花費(fèi)了大量的時(shí)間和精力來描述轉(zhuǎn)基因植物的特征，并忽視不必要的變化而不理解 - 從基本的生物學(xué)角度 - 為什么這些變化可能已經(jīng)發(fā)生，”Ecker說。“我們的新方法提供了一種更好地理解這些影響的方法，可能有助于加快這一過程。”

“最大的不確定因素是T-DNA是否與你想要的同時(shí)插入了多少拷貝，”前Salk研究員Florian Jupe說道，他現(xiàn)在在拜耳作物科學(xué)公司工作。Jupe，Salk員工研究員Mark Zander和研究助理Angeline Rivkin是新報(bào)的共同第一作者，以及J. Craig Venter研究所的Todd Michael。

由于T-DNA方法可以將所需基因的許多拷貝整合到植物中，因此用標(biāo)準(zhǔn)DNA測序研究最終結(jié)果可能是困難的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)技術(shù)難以對(duì)高度重復(fù)的DNA序列進(jìn)行測序。但是Ecker和他的同事們轉(zhuǎn)向了一種新的方法組合 - 包括光學(xué)測繪和納米孔測序 - 以高分辨率觀察這些長時(shí)間的延伸。他們將這些技術(shù)應(yīng)用于擬南芥(Arabidopsis thaliana)的四個(gè)隨機(jī)選擇的T-DNA系，擬南芥是生物學(xué)中常用的模型植物。(這些植物來自大量的T-DNA插入突變體，使用擬南芥轉(zhuǎn)化方法，稱為花浸，用于研究基因功能。)

光學(xué)作圖顯示植物在其基因組中具有一至七個(gè)不同的插入或重排，大小幾乎為十倍。兩個(gè)細(xì)胞系的基因組的納米孔測序和重建證實(shí)了單字母分辨率的插入，包括在所選擇的一條染色體之間已經(jīng)交換或易位的DNA的整個(gè)區(qū)段?；虿迦氡旧盹@示出多種模式，插入的DNA片段有時(shí)會(huì)被擾亂，倒置甚至沉默。

“這項(xiàng)研究甚至在一年前還不可能，”邁克爾說。“Nanopore測序，有些人稱之為DNA測序的'圣杯'，它甚至徹底改變了基因組的最復(fù)雜區(qū)域的讀數(shù)，這些區(qū)域到目前為止是完全無法接近和未知的。”

最后，當(dāng)研??究人員研究稱為組蛋白的遺傳物質(zhì)包時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)了其他變化。組蛋白將DNA包裝到結(jié)構(gòu)單元中，并且這些組蛋白的修飾介導(dǎo)基因是否可以被細(xì)胞使用(稱為表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)水平)。根據(jù)T-DNA整合的位置，某些附近的組蛋白修飾出現(xiàn)或消失，可能會(huì)改變其他附近基因的調(diào)節(jié)或激活。

“現(xiàn)在我們對(duì)T-DNA插入如何塑造局部表觀基因組環(huán)境有了第一個(gè)高分辨率的見解，”Zander說。

研究人員表示，在一個(gè)理想的世界中，T-DNA會(huì)插入一個(gè)所需基因的單一功能性拷貝，對(duì)植物的基因組沒有附近的副作用。雖然他們的研究結(jié)果表明在擬南芥中很少出現(xiàn)這種情況，但他們的方法為更好地理解和監(jiān)測這些影響提供了途徑。

“這項(xiàng)技術(shù)令人興奮，因?yàn)樗屛覀兏宄亓私膺@些轉(zhuǎn)基因擬南芥品系中的情況，”Rivkin說。

“對(duì)于擬南芥，它相對(duì)容易，因?yàn)樗哂腥绱诵〉幕蚪M，但由于DNA測序技術(shù)的持續(xù)改進(jìn)，我們預(yù)計(jì)這種方法也可用于作物植物，”Ecker補(bǔ)充說，他是Salk國際理事會(huì)遺傳學(xué)主席。 。“目前的方法需要篩選數(shù)百種轉(zhuǎn)基因品系以找到性能良好的品系，例如那些沒有額外插入的品系，因此這項(xiàng)技術(shù)可以提供更有效的方法。”