萊斯大學(xué)的生物工程師已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了精確基因組編輯的新技術(shù)，這些技術(shù)更準(zhǔn)確，并且具有更少的脫靶錯(cuò)誤。在即將發(fā)表的關(guān)于改進(jìn)革命性基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9的特刊“自然期刊分子治療 ”中，三篇論文分享了這些新策略。

生物工程學(xué)教授Gang Bao及其同事提出了使用能夠切割DNA的生物催化劑(稱(chēng)為“工程化核酸酶”)最大化目標(biāo)基因編輯的想法。多年來(lái)已經(jīng)研究了幾種這樣的系統(tǒng)，但是在過(guò)去的三年中，通過(guò)CRISPR-Cas9進(jìn)行剪切和粘貼編輯的前景引起了全世界科學(xué)家的關(guān)注。

CRISPR-Cas9是細(xì)菌中天然存在的防御系統(tǒng)，它允許研究人員設(shè)計(jì)一種稱(chēng)為“指導(dǎo)RNA”的短序列RNA，其靶向細(xì)胞中特定的遺傳密碼(DNA)部分。然后，相關(guān)的Cas9蛋白切割切片，破壞切片或用所需的代碼替換它。

這就是細(xì)菌利用CRISPR-Cas9從疾病中免疫的方式。暴露于入侵者會(huì)通過(guò)將入侵者的遺傳特征添加到CRISPR數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)使細(xì)菌適應(yīng)。然后細(xì)菌識(shí)別未來(lái)的敵人并用適當(dāng)?shù)腃as9蛋白質(zhì)摧毀它們。

大約三年前，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR-Cas9可被修飾以編輯人類(lèi)細(xì)胞中的DNA，例如，用正?；?ldquo;野生型”序列替換突變序列，其方式與細(xì)菌入侵入侵者DNA的方式大致相同。簽名。該技術(shù)被視為具有疾病建模和治療，合成生物學(xué)和分子途徑解剖的巨大潛力。

但是，CRISPR-Cas9仍然容易被剪掉錯(cuò)誤的序列 - 稱(chēng)為“脫靶” - 除了正確的序列之外。在治療應(yīng)用中，Bao說(shuō)，CRISPR-Cas9的脫靶切割可能會(huì)導(dǎo)致許多不利影響，包括癌癥。

Bao于2015年獲得了德克薩斯州癌癥預(yù)防與研究所的資助，于2015年轉(zhuǎn)到Rice的生物科學(xué)研究合作組織(BRC)，正在研究改進(jìn)CRISPR-Cas9的方法，他稱(chēng)之為“用于編輯基因的納米剪刀”。

他的目標(biāo)之一是治療遺傳性疾病鐮狀細(xì)胞性貧血，他希望CRISPR-Cas9最終治愈。但首先，治療必須變得更好，以避免可能導(dǎo)致不良副作用的脫靶。

在其中兩篇論文中，研究人員研究了不同的直系同源物：Cas9蛋白來(lái)自與CRISPR / Cas9中常用的化膿性鏈球菌(Spy)細(xì)菌具有相同祖先的物種。

“我們?cè)谶@些論文中的方法是探索使用不同Cas9直向同源物的可能性，”鮑說(shuō)。“有很多種可能性。”

在第一篇論文中，Bao和他的小組利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)來(lái)表征來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌(Nme)細(xì)菌的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。他說(shuō)，它與Spy的不同之處在于生物工程師可以用來(lái)降低脫靶編輯的風(fēng)險(xiǎn)。

這種差異主要在于一系列代碼不是目標(biāo)的一部分，而是靠近目標(biāo)。它被稱(chēng)為原型間隔區(qū)相鄰基序(PAM)，它是靶DNA序列的標(biāo)記，是Cas9蛋白結(jié)合所必需的。在Spy Cas9編輯中，PAM序列通常是三個(gè)核苷酸長(zhǎng)。對(duì)于Nme，所需的PAM序列顯著更長(zhǎng)--8個(gè)核苷酸。研究人員表示，雖然Nme可能會(huì)找到更少的目標(biāo)，但這些目標(biāo)更可能是正確的目標(biāo)。他們認(rèn)為，這可能使其成為基因編輯的更安全的替代品。

第二篇論文是與德國(guó)弗萊堡大學(xué)的同事合作，利用另一種細(xì)菌的免疫系統(tǒng)解決了高度特異的人類(lèi)基因編輯問(wèn)題。對(duì)于這項(xiàng)研究，來(lái)自Spy的Cas9蛋白被嗜熱鏈球菌(Sth)蛋白替代，這些蛋白也識(shí)別更長(zhǎng)的PAM。在人類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行的測(cè)試發(fā)現(xiàn)，具有更嚴(yán)格的PAM要求的Sth 蛋白在避免脫靶時(shí)顯著優(yōu)于Spy Cas9蛋白。

Bao和公司還研究了可影響靶向的DNA和RNA中凸起的影響。當(dāng)序列比引導(dǎo)RNA靶向的預(yù)期DNA序列長(zhǎng)一個(gè)核苷酸或短一個(gè)核苷酸時(shí)，出現(xiàn)凸起。

“我們發(fā)現(xiàn)，即使DNA或RNA膨脹，Cas9蛋白仍可以切割，”他說(shuō)。“這是一個(gè)獨(dú)特的貢獻(xiàn)。沒(méi)有人看到會(huì)是這種情況，但我們證明了這一點(diǎn)。因此，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于Web的工具來(lái)搜索三個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，其中包含堿基錯(cuò)配，RNA凸起和DNA凸起“。

Bao指出，與Spy不同，Nme和Sth Cas9蛋白小到足以包裝在腺相關(guān)病毒中，用于遞送和治療動(dòng)物中的特定細(xì)胞。“這是另一個(gè)優(yōu)勢(shì)，也是我們?yōu)槭裁匆^續(xù)探索這兩個(gè)系統(tǒng)，”他說(shuō)。

第三篇論文是對(duì)當(dāng)前CRISPR-Cas9技術(shù)的綜述，該技術(shù)側(cè)重于可用于靶標(biāo)選擇，實(shí)驗(yàn)方法和驗(yàn)證的基因組編輯工具。鮑和他的團(tuán)隊(duì)還列出了一系列尚未解決的挑戰(zhàn)，以消除脫靶效應(yīng)。

他說(shuō)有一條前進(jìn)的道路，部分原因在于他對(duì)兩種新細(xì)菌系統(tǒng)的研究，以及CRISPR-Cas9在實(shí)驗(yàn)室中比其他基因組編輯系統(tǒng)如TALEN和鋅指更容易實(shí)施的事實(shí)。核酸酶。

Bao說(shuō)，與那些較舊的基因組編輯技術(shù)不同，CRISPR-Cas9很容易讓學(xué)生在短時(shí)間內(nèi)學(xué)習(xí)和使用。

Bao希望將他的實(shí)驗(yàn)室建立為德克薩斯醫(yī)療中心基因組編輯的焦點(diǎn)。為此，他于去年12月將TMC基因組編輯社區(qū)聚集在一起參加BRC的一次參加人數(shù)眾多的研討會(huì)。

“我們進(jìn)行了很多討論，”他說(shuō)。“我想激發(fā)的一件事是在TMC的許多實(shí)驗(yàn)室中使用CRISPR形成一個(gè)聯(lián)盟。他們需要針對(duì)不同的應(yīng)用設(shè)計(jì)CRISPR系統(tǒng)，但是有很多共同的問(wèn)題。如果我們一起工作，它將會(huì)更容易解決它們。“

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