研究人員希望為廣泛的疾病開發(fā)疫苗，治療和新的診斷測試。要做到這一點，他們需要更好地了解一類關鍵的生物成分。被稱為表面膜蛋白，疾病過程中的這些重要成分形成了結構和功能上多樣化的巨大復雜性組合。

在一項新的研究中，亞利桑那州立大學生物設計研究所的研究教授黛布拉漢森探索了一種研究由一對高致病性生物體產生的膜蛋白的創(chuàng)新方法。該研究小組表明，基于DNA的遺傳免疫，使用一種稱為基因槍的裝置，可以在小鼠中成功表達膜蛋白，并誘導動物產生一系列針對細菌和病毒靶標的關鍵抗體。

“我們了解到我們的新抗體生產過程非常有效。如果膜蛋白天然具有免疫原性，我們很容易僅使用基因產生高水平的抗體，”Hansen說。“在免疫接種之前，我們讓免疫接種的宿主為我們工作，而不是費力地凈化膜蛋白并試圖在洗滌劑中保持適當?shù)牡鞍踪|結構。”

該新研究還描述了一種在試管中表達和純化膜蛋白并檢測它們與從基因免疫小鼠中提取的血液中的特異性抗體的結合活性的方法。

通常，產生對外來蛋白質的免疫應答需要純化蛋白質，然后將其注射到動物體內。該過程繁瑣，具有挑戰(zhàn)性且耗時。在目前的研究中，通過直接引入編碼目的蛋白質的基因產生免疫應答。

通過重組DNA的過程，研究中產生的兩種膜蛋白也被成功地引入細菌大腸桿菌的膜中。使用來自基因免疫小鼠的血液中存在的特異性抗體首次證明兩種膜蛋白可以在活生物體中重組表達，正確折疊成適當?shù)?-D結構并遷移到大腸桿菌內的膜上。這些結果現(xiàn)在有助于這兩種關鍵毒力蛋白的結構測定。

這項研究發(fā)表在最新一期的自然出版集團期刊“ 科學報告”中，有望為對醫(yī)學至關重要的膜蛋白的結構和功能提供新的見解。

在表面上

膜蛋白涉及生物體中的無數(shù)功能，包括細胞信號傳導和通信，能量轉換和利用，分子運輸和催化。由于他們參與了一系列疾病，他們最近成為新一系列治療方法的主要目標。實際上，超過50%的治療靶標是膜蛋白。隨著對膜蛋白結構和功能的了解越來越多，預計這一數(shù)字將會上升。

盡管它們在宿主/病原體相互作用以及藥物/細胞關系中作為分子界面具有重要作用，但膜蛋白在目前編目的100,000個獨特蛋白質結構中占不到1%。這主要是由于生產，純化和確定膜蛋白結構所涉及的嚴重挑戰(zhàn)。Hansen和她的同事概述了生產抗體特異性蛋白質的新策略，這些蛋白質由免疫系統(tǒng)自然產生，以應對病原體或其他威脅生物制劑。

在目前的研究中，他們描述了使用基因槍將DNA信息引入小鼠。手持設備使用一股氣體將含有稱為質粒的環(huán)狀DNA浸漬的金顆粒推入小鼠皮膚。金顆粒被稱為微納米復合物。基因槍技術由生物設計醫(yī)學創(chuàng)新中心的聯(lián)合主任Stephen A. Johnston開創(chuàng)并開發(fā)。

通過基因槍引入的遺傳物質被小鼠樹突細胞攝取并在真皮組織和淋巴結中翻譯成膜蛋白。小鼠免疫系統(tǒng)通過產生能夠結合膜蛋白的特異性抗體來響應。雖然遺傳免疫的基本技術已經使用了一段時間，但該研究首次描述了這種方法對膜蛋白的廣泛適用性，以及DNA-金微納米復合物首次應用以刺激抗體產生。

檢查了細菌和病毒威脅

結果顯示，基因免疫成功地產生了來自兩種生物安全3級病原體的17種膜蛋白中的12種特異性抗體：土拉弗朗西斯菌和非洲豬瘟病毒(ASFV)。F. tularensis引起疾病tularemia。它是一種廣泛研究的傳染性病原體，因其能夠侵入多種細胞類型并巧妙地逃避免疫系統(tǒng)而臭名昭著。它是地球上最致病的細菌之一，只能通過10個細胞引起致命的感染。非洲豬瘟病毒由節(jié)肢動物攜帶。豬的感染導致致命和無法治愈的出血性疾病，這種疾病已經破壞了非洲和東歐地區(qū)的豬群。

對這些生物體產生的內源性疾病蛋白質的研究很困難，需要專門的安全設施和方案，因為它們可能給研究人員帶來危險。所描述的新方法允許通過基于DNA的方法產生這些病原體的膜蛋白和相關抗體，允許安全處理生物材料而沒有感染風險。

一旦在小鼠中產生了針對特定膜蛋白的抗體，該組試圖表征所得的小鼠血液或血清。為此，開發(fā)了在疏水性磁珠(IVT-HMB)存在下稱為體外翻譯的新系統(tǒng)。在此，在試管中產生小質量的膜蛋白，同時使用疏水珠提取，然后針對從基因免疫的小鼠中提取的血清進行篩選。在兩種類型的診斷測試或測定(ELISA和蛋白質印跡)中檢測所得信號確定了在小鼠血清中存在對每種膜蛋白特異的抗體。IVT-HMB方法代表了膜蛋白生產的強大精簡，排除了傳統(tǒng)上需要的艱苦的分離和純化過程。

踏腳石到蛋白質結構

使用X射線成像微小的蛋白質晶體是確定詳細蛋白質結構的有效方法，但該技術面臨許多挑戰(zhàn)，包括難以生產和純化正確組裝的蛋白質。目前的研究標志著膜蛋白進一步結構表征的起點，使用冷凍EM和X射線晶體學等技術。

新研究的共同作者，生物設計研究所應用結構發(fā)現(xiàn)中心的主編Petra Fromme強調了這項新研究的力量：“通過遺傳免疫等技術產生的抗體范圍打開了高分辨率分子圖像的大門重要的膜蛋白，“她說。“由此產生的抗體有助于以各種重要方式進行結構測定，識別正確組裝的蛋白質，幫助誘導蛋白質與其他蛋白質組裝成有序的晶體，并穩(wěn)定或捕獲可以使用X射線成像的活躍狀態(tài)的蛋白質。”

在下一階段的研究中，該小組計劃使用相同的免疫程序生產單克隆抗體。這些作為共結晶結合因子或配體是必需的，用于通過X射線晶體學結構測定膜蛋白。作者進一步指出，通過基因免疫技術產生的單克隆抗體為未來針對廣泛疾病的治療提供了有吸引力的候選者。

這項研究由生物設計研究所的教師共同完成，包括來自醫(yī)學創(chuàng)新中心(CIM)的Debra Hansen，應用結構發(fā)現(xiàn)中心(CASD)和分子科學學院(SMS)，來自CIM的Kathryn Sykes和來自CASD和SMS的Petra Fromme，以及他們的研究人員和學生團隊，包括：研究科學家Mark Robida，Andrey Loskutov和Tien Olson，研究員Felicia Craciunescu，John-Charles Rodenberry和Hetal Patel以及來自CIM和博士后Katerina的研究生Xiao Wang來自SMS的Dörner。

用于應用該方法的所有必需克隆(質粒DNA)可通過DNASU Plasmid Repository獲得，該DNA存儲在Biodesign的個性化診斷中心。