許多未培養(yǎng)的微生物在調(diào)節(jié)地球的生物地球化學(xué)過程中扮演著不為人知的角色; 從調(diào)節(jié)植物健康到在陸地和海洋環(huán)境中推動(dòng)養(yǎng)分循環(huán)，以及可能影響全球氣候的過程。雖然研究人員正在利用多種方法來識別這些被稱為“微生物暗物質(zhì)”的微生物，并確定它們正在做什么，但大多數(shù)技術(shù)都不允許它們同時(shí)進(jìn)行這兩種微生物。

在網(wǎng)上公布2016年6月28日，一項(xiàng)研究的美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(PNAS)，研究人員在加利福尼亞技術(shù)學(xué)院(加州理工學(xué)院)和能源部聯(lián)合基因組研究所，美國能源部(DOE JGI)的美國能源部辦事處科學(xué)用戶設(shè)施，利用最近改進(jìn)的技術(shù)來識別個(gè)體活躍細(xì)胞，以及微生物群落內(nèi)的活躍細(xì)菌和古細(xì)菌的單個(gè)聚類。了解地球微生物多樣性的真實(shí)范圍是DOE感興趣的，以便了解如何利用它們來應(yīng)對各種能源和環(huán)境挑戰(zhàn)。

“探索微生物暗物質(zhì)的最大問題之一是到目前為止，確定何時(shí)未培養(yǎng)的微生物具有代謝活性以及它們在系統(tǒng)中的生態(tài)功能是非常復(fù)雜的，”研究第一作者Roland Hatzenpichler說，他是博士后研究人員在加州理工學(xué)院微生態(tài)生態(tài)學(xué)家Victoria Orphan工作。作為DOE生物與環(huán)境研究(BER)計(jì)劃的一部分，Orphan的實(shí)驗(yàn)室一直在研究未培養(yǎng)微生物的生態(tài)學(xué)和生理學(xué)，催化環(huán)境中甲烷的厭氧氧化。“當(dāng)我們處理生活在復(fù)雜社區(qū)內(nèi)的環(huán)境或寄主相關(guān)生物 - 通常同時(shí)發(fā)生數(shù)千種或更多種 - 時(shí)，很難確定個(gè)體物種或細(xì)胞的作用。歷史上，這已經(jīng)使用單細(xì)胞分辨同位素標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)。這是一種相對繁瑣且昂貴的方法，但是非常具體和敏感。但是，如果我們想要更好地理解微生物組功能我們需要新的，互補(bǔ)的方法，更高通量，可以并行化，并且便宜。BONCAT [新技術(shù)]就是這樣一種方法。“

BONCAT：了解微生物體功能的高通量技術(shù)

BONCAT是生物正交非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸標(biāo)記的縮寫，是加州理工學(xué)院開發(fā)的用于生物工程研究的技術(shù)，但由Hatzenpichler和Orphan改編用于微生物生態(tài)學(xué)研究。BONCAT使用合成氨基酸標(biāo)記蛋白質(zhì)制造細(xì)胞。然后可以用熒光標(biāo)簽對這些氨基酸進(jìn)行染色，在其棲息地中點(diǎn)亮活性細(xì)胞。在這項(xiàng)研究中，Hatzenpichler及其同事使用從俄勒岡州和加利福尼亞州沿海地區(qū)的深海甲烷滲漏沉積物中收集的沉積物樣本進(jìn)行了一系列孵化實(shí)驗(yàn)，追蹤甲烷代謝細(xì)菌和古菌種群的緩慢生長。

加州理工學(xué)院的研究人員將BONCAT與熒光原位雜交(FISH)相結(jié)合，分析這些模擬環(huán)境中的活性微生物，并確定它們在哪些條件下具有活性。“通常，每個(gè)甲烷滲漏部位都有幾個(gè)不同的古菌甲烷氧化劑，”Hatzenpichler說。“一個(gè)長期存在的假設(shè)是，來自這些群體的不同成員在不同時(shí)間具有不同的活性。通過利用以相對高通量模式進(jìn)行BONCAT分析的能力，我們發(fā)現(xiàn)所有甲烷氧化古菌群的成員都是合成活性的在孵化期間?，F(xiàn)在我們可以開始問為什么了。“

應(yīng)用BONCAT技術(shù)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)

然后，DOE JGI研究人員幫助開發(fā)了一個(gè)流程，使團(tuán)隊(duì)能夠?qū)ONCAT應(yīng)用于流式細(xì)胞儀。“這與單細(xì)胞基因組學(xué)的過程相同，但對于共生細(xì)菌和古細(xì)菌的聚集，”DOE JGI微型應(yīng)用組負(fù)責(zé)人Rex Malmstrom稱該技術(shù)稱為BONCAT-FACS(BONCAT - 熒光激活細(xì)胞分選)。“我們正在對在模擬環(huán)境中活躍的細(xì)胞的單個(gè)聚集體進(jìn)行分類，并且通過細(xì)胞分選儀我們可以抓取活性細(xì)胞來研究它們。我們必須弄清楚如何調(diào)整流式細(xì)胞儀的過程。排序后，我們對單個(gè)聚集體進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后對16S rRNA標(biāo)記基因進(jìn)行測序，以鑒定包含聚集體的細(xì)胞。我們現(xiàn)在對這些樣本進(jìn)行全基因組測序。“

通過BONCAT-FACS，研究小組發(fā)現(xiàn)，甲烷氧化古菌并不像已經(jīng)預(yù)期的那樣只與已知的硫酸鹽還原菌相互作用，但有時(shí)也會(huì)與研究較少的Verrucomicrobia門的成員聯(lián)系起來。之前沒有發(fā)現(xiàn)過這些相互作用，研究結(jié)果表明，甲烷氧化古菌具有比人們想象的更廣泛的共生關(guān)系。目前正在解決這些相互作用是否對兩種細(xì)胞類型都有益的問題。

“JGI的主要力量在于能夠破譯微生物的遺傳密碼，”哈森皮奇勒說。“通過合作，我們能夠從樣本中分離出與溫室氣體甲烷降解相關(guān)的單個(gè)細(xì)胞群，確定參與該過程的細(xì)胞伙伴，并深入了解其遺傳密碼。” Orphan和她的團(tuán)隊(duì)計(jì)劃利用配對的甲烷氧化古菌和細(xì)菌伴侶的基因組信息，深入了解在環(huán)境中共存的不同甲烷營養(yǎng)菌群之間的相互作用和能量交換的生理學(xué)和機(jī)制。

秋季，Hatzenpichler將在蒙大拿州立大學(xué)博茲曼分校開設(shè)自己的實(shí)驗(yàn)室。他將繼續(xù)與DOE JGI研究人員密切合作，揭示未培養(yǎng)微生物的生物地球化學(xué)影響和生物技術(shù)潛力。