正如醫(yī)生尋求用超聲波檢查，CT和MRI掃描更深入身體，天文學家利用太空望遠鏡，自適應光學器件和不同波長的光線尋求進一步觀察宇宙，神經(jīng)科學家尋求新的方法來觀察腦細胞深入大腦內(nèi)部。最近出現(xiàn)了三光子顯微鏡，讓他們比以往更深入地了解腦細胞?，F(xiàn)在，基于對該技術的實質(zhì)性改進，麻省理工學院的科學家們已經(jīng)開展了第一項研究，通過每個視覺皮層，特別是下面神秘的“亞板”，喚醒老鼠的刺激神經(jīng)活動。

“通過優(yōu)化光學設計和其他參數(shù)，以便在大腦中進行測量，我們能夠?qū)嶋H制作以前無法實現(xiàn)的新發(fā)現(xiàn)，”共同通訊作者，皮科爾研究所牛頓神經(jīng)科學教授Mriganka Sur表示。學習和記憶。該論文的共同主要作者是博士后Murat Yildirim和Hiroki Sugihara。另一位通訊作者是機械工程和生物工程教授Peter So。

“這個概念已經(jīng)存在，但問題是你如何讓它發(fā)揮作用，”蘇爾說。

該研究發(fā)表在Nature Communications上，研究小組表明，當老鼠觀察視覺刺激時，他們的人類觀察者可以測量所有六層視皮層和亞板中神經(jīng)元之間的活動模式，提供有關它們在哺乳動物如何處理中的作用的新數(shù)據(jù)視力。此外，通過一系列仔細的實驗??，研究人員能夠證明他們發(fā)出的光線，以及回來的光線，既沒有損壞，也沒有改變他們測量的細胞。

總之，本文描述了一種新型三光子顯微鏡，該顯微鏡經(jīng)過優(yōu)化，能夠提供快速，短，低功率的光脈沖，能夠在不引起任何功能性干擾或物理損傷的情況下到達深部目標，然后檢測由細胞發(fā)出的熒光。高效率地生成具有清晰分辨率和快速幀速率的圖像。

“我們有動力展示我們可以用三光子顯微鏡技術處理清醒狀態(tài)下的動物，這樣我們就可以提出神經(jīng)科學的重要問題，”Yildirim說。“你可以認為你擁有世界上最好的顯微鏡，但在你問這些問題之前，你不知道你會得到什么結(jié)果。”

飛秒和納焦耳

多光子顯微鏡背后的理論可以追溯到1931年Maria Goeppert-Mayer的博士論文，他的研究表明，低能光子的同時組合可以將原子或分子激發(fā)到更高的能量狀態(tài)，就像單個更高能量的光子一樣可以。1990年，康奈爾大學的科學家們將這種洞察力應用于雙光子顯微鏡中的生物成像，并在2013年再次應用三光子示波器。這些允許神經(jīng)科學家更深入地觀察大腦，因為較低能量，較高波長的光子比較高能量，較短波長的光子更不容易被細胞分子如脂質(zhì)散射。

Sur和So在麻省理工學院的實驗室加入了推動多光子顯微鏡的前沿。在新的研究中，他們表明他們現(xiàn)在已經(jīng)足夠遠，可以研究活體神經(jīng)活動。為此，該團隊試圖根據(jù)他們成像的腦組織特性的細致測量，改進激光和示波器光學系統(tǒng)的許多不同參數(shù)。例如，他們不僅測量了細胞開始顯示明顯損傷的能量(約10納焦耳)，還測量了細胞開始表現(xiàn)不同的能量，從而產(chǎn)生受測量影響的數(shù)據(jù)(2至5納焦耳) 。憑借精確度和目的，提供更低的能量水平，科學家優(yōu)化了范圍，發(fā)出令人難以置信的短脈沖光，持續(xù)時間僅為40毫秒的“脈沖寬度”，

史無前例的神經(jīng)科學

在仔細驗證優(yōu)化的三光子示波器的測量結(jié)果與雙光子示波器(在皮層較淺的層)和電生理學(可以更深入，但是盲目地)的測量結(jié)果一致之后，該團隊開始做一些前所未有的神經(jīng)科學 - 直接目視觀察清醒，表現(xiàn)動物的所有皮層中的神經(jīng)活動。

在實驗室中，他們向小鼠顯示了12個不同旋轉(zhuǎn)方向的一些光柵圖案和屏幕上的兩個運動方向。通過優(yōu)化的三光子范圍，他們觀察了皮層每層中的神經(jīng)元 - 超過一毫米深 - 看看細胞如何對這種標準視覺輸入作出反應。他們可以看到細胞的活性，因為他們使用名為GCaMP6s的標簽將它們設計為在鈣活性升高時發(fā)光。他們可以通過稱為“三次諧波產(chǎn)生”的現(xiàn)象看到其他組織，如血管和白質(zhì)。

他們能夠看到最深的層，他們觀察到第5層神經(jīng)元被“廣泛地”調(diào)整為方向，這意味著它們可以響應各種各樣的方向，而不僅僅是一個或兩個特定的方向。第5層神經(jīng)元也比其他層中的細胞具有更多的自發(fā)活動，并且與大腦更深部分的連接更多。同時，第6層神經(jīng)元的定向調(diào)整比其他層中的神經(jīng)元稍微更清晰，這意味著它們對不同方向的響應更具特異性。

Subplate驚喜

他們最令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，亞板是一層薄薄的神經(jīng)“白質(zhì)”纖維，是一群神經(jīng)元的家園，其活動模式微弱且廣泛地適應視覺輸入。研究人員說，這一發(fā)現(xiàn)具有啟發(fā)性，因為許多神經(jīng)科學家認為，亞板神經(jīng)元在發(fā)育過程中大多只是活躍的。Yildirim說，這層也太薄了，用電生理學測量。

“到目前為止，由于在體內(nèi)成像這些細胞的技術挑戰(zhàn)，成熟大腦中的亞板神經(jīng)元尚未被研究過，”研究人員寫道。

Sugihara回憶起Yildirim第一次向他展示亞板神經(jīng)元在成熟小鼠中是活躍的。“他們在那里做什么?” 他回憶起驚訝地問道。

現(xiàn)在他們繼續(xù)使用他們的新范圍來回答這個問題。

美國國立衛(wèi)生研究院，國家科學基金會，Picower研究所工程合作撥款和馬薩諸塞州生命科學倡議支持該研究。