【導(dǎo)讀】想必大家都知道，ODNan技術(shù)是近年認(rèn)識的在作用方式上不同于反義寡脫氧核苷酸( ODNas)的一種基因表達(dá)的調(diào)控手段，能與雙鏈DNA分子特異性結(jié)合形成局部三螺旋結(jié)構(gòu)，從 而在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達(dá)1，2。通過三螺旋形成，ODNan充當(dāng)了切割DNA的“分 子剪刀”，提供了基因治療的新策略。

反基因寡脫氧核苷酸技術(shù)

ODNas在體外能抑制HBV復(fù)制。ODNas的靶點(diǎn)為RNA，在翻譯水平發(fā)揮作 用，有一定局限性，若能直接抑制HBV基因轉(zhuǎn)錄，則抗HBV效果可能更強(qiáng)。ODNan即不同于ODN as，能與含同聚嘌呤嘧啶序列的雙螺旋DNA形成三螺旋結(jié)構(gòu)而直接在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮抑制作用

HBV Cp 1734 nt～1754 nt存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1位點(diǎn)，是決定HBV Cp活性的 重要部位;該區(qū)域?yàn)橥坂堰枢奏ば蛄衃7]，又具有形成三螺旋的結(jié)構(gòu)特點(diǎn);此外 ，HBV基因功能，復(fù)制特點(diǎn)決定了HBV前基因組RNA 5′端起始區(qū)可能是HBV反義治療的最佳靶 點(diǎn)。因此，本文選擇這兩區(qū)域?yàn)镺DNan、ODNas作用靶點(diǎn)，進(jìn)行抗HBV研究，尚未見類似的研 究報(bào)道。

本研究表明ODNan21、ODNas21能明顯抑制HBV復(fù)制及抗原合成，并對細(xì)胞無毒副作用。其抑 制呈劑量依賴性。兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)抑制作用增強(qiáng)。由于ODNan21作用于轉(zhuǎn)錄水平，ODNas21作 用于翻譯水平，因此，兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)HBV前C、C基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及HBV復(fù)制三個(gè)環(huán)節(jié)均可 能被抑制故作用增強(qiáng)。該結(jié)果提示，作用于HBV生活周期不同環(huán)節(jié)的藥物聯(lián)合應(yīng)用可能提高 抗HBV效果。

我們設(shè)計(jì)的ODNan21針對HBV Cp Sp1，作用于轉(zhuǎn)錄水平;ODNas21作用于翻譯水平。從理論上 看，ODNan21應(yīng)顯示更強(qiáng)的抑制作用。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ODNan21對HBeAg、HBsAg的抑制反略低 于ODNas21。其原因不太清楚，可能與所用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞有關(guān)。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子Sp1對HBV Cp活性的 調(diào)控呈細(xì)胞特異性。在去分化細(xì)胞，如Hep G2.1細(xì)胞系，Sp1的調(diào)控作用較強(qiáng);而在分化細(xì) 胞 ，如Hep G2細(xì)胞系(包括22.1.5細(xì)胞)，Sp1對HBV Cp的調(diào)控作用較弱[9]，因此，在 2 2.1.5細(xì)胞，即使應(yīng)用ODNan21封閉了Sp1，對HBV基因表達(dá)及復(fù)制的抑制也可能不很強(qiáng)?？梢?推測，在正常分化的肝細(xì)胞中，ODNan21可能顯示出更強(qiáng)的抗HBV作用。

本研究顯示，ODNan及ODNas能有效抑制HBV復(fù)制，這無疑為乙型肝炎的治療提供了新思路。但這僅是體外的初步研究結(jié)果，如何降低合成寡核苷酸的成本;如何將ODNan、ODNas定向?qū)?入肝細(xì)胞及明確其在動物體內(nèi)的藥效、藥代動力學(xué)等將是今后急需研究的課題。

材料與方法

22.1.5細(xì)胞培養(yǎng)

22.1.5細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了HBV(ayw亞型)全基因組，能分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA及HBV顆粒的人 肝母瘤細(xì)胞系[6]，由第一軍醫(yī)大學(xué)駱抗先教授惠贈。用含10%胎牛血清及G418(400 μg/ml)的DMEM(Sigma公司產(chǎn)品)培養(yǎng)基按常規(guī)方法培養(yǎng)。

硫代磷酸反基因及反義寡核苷酸合成

選擇HBV(ayw)Cp Sp1位點(diǎn)(1734 nt～1754 nt)設(shè)計(jì)21聚反基因寡核苷酸(ODNan21)，序列為T GTGGTGGGGAAGTGGTGGG;以HBV前C、前基因組RNA 5′端起始區(qū)(1813 nt～1833 nt)設(shè)計(jì)21聚 反 義寡核苷酸(ODNas21)，序列為CAGAGGTGAAAAAGTTGCATGGT;無關(guān)序列對照寡核苷酸(ODNcon) ，序列為GGGTGGTGAAGGG-GTGGTGT。采用固相亞磷酰胺三酯合成法在DNA合成儀(美國AB I公司)上由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所協(xié)助合成。

抗病毒作用檢測

將22.1.5細(xì)胞以2×105 個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板，同時(shí)加入不同劑量ODNan21、ODNas21及 ODNcon,12 h再給藥1次繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓φ占?xì)胞僅加培養(yǎng)基。每12 h 收集50 μl培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)(中山生物公司試劑盒)一次性檢 測HBsAg、HBeAg含量，結(jié)果以P/N值表示，按下式計(jì)算抑制率：

抑制率=(對照孔P/N-實(shí)驗(yàn)孔P/N)÷(對照孔P/N-2.1)×100%

按常規(guī)方法抽提各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA，以地高辛標(biāo)記的HBV DNA探針采用斑點(diǎn)雜

細(xì)胞毒性試驗(yàn)

22.1.5細(xì)胞傳代培養(yǎng)24 h后，換含不同濃度ODNan21的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度接種3孔。設(shè)不加OD Nan21的22.1.5細(xì)胞作對照。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，采用放射免疫法檢測培養(yǎng)上清中甲胎蛋白水平 ，并觀察細(xì)胞生長情況、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞破壞程度。

值得一提的是，ODNan技術(shù)針對HBV核心啟動子(HBV Cp)Sp1位點(diǎn)的ODNan及針對HBV 前C、前基因組RNA 5′端起始區(qū)的ODNas的抗HBV作用。