一例奶牛發(fā)生牛支原體肺炎的診斷
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卞圈哪沖?2011?2?科技 ??。臁?
一例奶牛發(fā)生牛支原體肺炎的診斷
胡長(zhǎng)敏 ,彭清潔1,3,陳穎鈺1,2,巴曉亮1’2,自智迪 ,郭愛珍
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,武漢430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430070;
3.國(guó)家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制功能研究室,武漢430070)
中圖分類號(hào):¥858.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004—4264(201?。保埃病埃埃埃薄埃场?/p>
摘要:牛支原體是嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)發(fā)展的重要病原。2008年我們報(bào)道牛支原體導(dǎo)致“肉牛傳染性牛支原體肺
炎”以來(lái),主要在肉牛發(fā)現(xiàn)該病。本文從臨床出現(xiàn)類似癥狀的運(yùn)輸后發(fā)病奶牛采集樣本,經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)和支原體
培養(yǎng)、特異性PCR擴(kuò)增和16S rRNA測(cè)序等病原學(xué)檢測(cè)證實(shí)為牛支原體感染?!?/p>
關(guān)鍵詞:牛支原體;奶牛;感染;呼吸系統(tǒng)疾病
牛支原體(Mycoplasma?。猓铮觯椋螅┦歉腥九5囊环N
公司。按照文獻(xiàn)[41配制支原體液體與固體培養(yǎng)基,但
重要病原,除導(dǎo)致牛肺炎、腺炎外.還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、 培養(yǎng)基中未加1%醋酸鉈溶液?!?/p>
角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等多種?。保臣?xì)菌的分離培養(yǎng)
疾病【l1。在過(guò)去的兩年中,我們確診了數(shù)十起肉牛的
按文獻(xiàn)嘲取小塊組織樣本切面涂抹TSA平板,
牛支原體肺炎圜,發(fā)病牛都在不久前經(jīng)歷過(guò)長(zhǎng)途運(yùn)輸。
劃線接種,37c【=恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。菌落線培養(yǎng)后。用革
近期湖北某奶牛場(chǎng)新購(gòu)人9l頭奶牛,部分出現(xiàn)發(fā)燒、 蘭氏染和油鏡觀察進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定?!?/p>
流涕、咳嗽、伴腹瀉、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀,就診時(shí)已死 1.4 細(xì)菌的16S?。颍遥危凌b定
亡15頭。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診為牛支原體肺炎,現(xiàn)就該奶 無(wú)菌牙簽挑取單個(gè)菌落,加入裝有適量滅菌水
牛場(chǎng)臨床發(fā)病與病原學(xué)鑒定情況報(bào)告如下?!?/p>
的無(wú)菌離心管中,煮沸10rain,冰?。保恚椋?,12?。埃埃埃颍恚椋睢?/p>
1材料與方法 離心30s,取上清作為DNA模板,按照本實(shí)驗(yàn)室建
1.1 樣品 立的方法,用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增【3J.
湖北某地奶牛場(chǎng)無(wú)菌采集并送檢的奶牛肺臟、 所得PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆至pMD一18T載體中.
喉及氣管樣品3份?!?/p>
送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果
1.2培養(yǎng)基
與GenBank中的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比對(duì).確定菌
胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptose?。樱铮帷。粒纾幔?,TSA) ̄ 株鑒定結(jié)果?!?/p>
胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy?。拢颍铮簦瑁裕樱拢┡囵B(yǎng)基
1.5牛支原體分離培養(yǎng)
購(gòu)自BD公司。按照試劑說(shuō)明配置TSA固體培養(yǎng)基
分別將小塊肺組織樣本、氣管拭子、喉拭子涂
及TSB液體培養(yǎng)基。類胸膜肺炎(Pleuropneumonia—
于PPLO固體培養(yǎng)基表面,于含5%CO 的細(xì)胞培養(yǎng)
like organisms,PPLO)肉湯粉、酵母粉、瓊脂粉等購(gòu) 箱中培養(yǎng);同時(shí)將小塊組織樣本投入到PPLO液體培
自BD公司,MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司.馬血清購(gòu)
養(yǎng)基中。2~3d后,用光學(xué)顯微鏡低倍觀察菌落形態(tài)
自Hyclone公司,精氨酸購(gòu)自上海伯奧生物科技有限
支原體在固體培養(yǎng)基上菌落具有“煎蛋樣”典型特
收稿日期:2010—09一O7
征,液體培養(yǎng)基由紅變?yōu)辄S,并且透亮?!?/p>
基金項(xiàng)目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體 ̄(nycyt)r_38)建設(shè)專項(xiàng)資金資助?!?/p>
1.6牛支原體的PCR鑒定
作者簡(jiǎn)介:胡長(zhǎng)敏(1977一),男,湖北宜昌人,講師,博士,研究方向?yàn)椤?/p>
奶牛疾病
用本實(shí)驗(yàn)室鑒定的牛支原體PCR方法進(jìn)行鑒
通訊作者:郭愛珍?!《?,同時(shí)將PCR產(chǎn)物克隆至pMD一18T載體中,進(jìn)行
?2?
測(cè)序分析l?。常??!?/p>
1.7藥敏試驗(yàn)
利用藥敏紙片法(購(gòu)于杭州天河微生物試劑有
限公司)檢測(cè)敏感藥物。取純化菌落接種于TSB液
體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜,制備固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂
平皿,在瓊脂表面均勻涂布菌液,將環(huán)丙沙星、恩諾
沙星、氧氟沙星、頭孢拉定、慶大霉素、丁胺卡那霉素、
四環(huán)素、紅霉素、磺胺、桿菌肽藥敏紙片貼在培養(yǎng)基
表面,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑,根據(jù)藥敏紙片說(shuō)明書
判定抗生素的敏感度。支原體藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)條件
同支原體分離培養(yǎng),其余步驟同細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)?!?/p>
2結(jié)果與分析
2.1發(fā)病牛的臨床癥狀
畜主反映,91頭泌奶牛分5次從山東省威?!?/p>
市山縣運(yùn)到湖北紅安縣,運(yùn)輸距離1?。保埃肮铩J状巍?/p>
運(yùn)牛時(shí)間是2010年4月5?。牛?,以后陸續(xù)運(yùn)牛。牛運(yùn)
回半月左右發(fā)病,至5月13日共死亡奶牛l5頭,死
亡率達(dá)16%。第3車牛運(yùn)輸時(shí)遇下雨,途中淋雨十多
個(gè)小時(shí),牛到場(chǎng)后第4天開始發(fā)病,發(fā)病率與死亡
率均較其他批次更高?!?/p>
發(fā)病初期體溫升高至41~42cC,患牛精神沉郁,
食欲急劇下降甚至廢絕,反芻減少或停止,部分?!?/p>
伴有陣發(fā)性咳嗽并流清亮鼻液。嚴(yán)重者呼吸困難、張
口呼吸;大多數(shù)牛出現(xiàn)腹瀉,少數(shù)牛糞便帶血;另外
部分牛出現(xiàn)跗關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)腫脹,跛行、不愿行走等
癥狀;病程稍長(zhǎng)的患牛表現(xiàn)消瘦?!?/p>
2.2病理變化
病死牛剖檢變化主要集中在肺部?;寂7闻K尖
葉、心葉及部分膈葉的局部有紅肉變區(qū)和大量壞
死灶散在分布:在病灶集中部位進(jìn)行橫切和縱切,
可見切面濕潤(rùn),輕輕擠壓見膿樣液體流出(圖1);肺
臟切塊投入水中后即沉入水底;從肺細(xì)支氣管內(nèi)可
擠出粘液或粘液樣分泌物,肺門淋巴結(jié)腫脹、出血;
氣管及喉內(nèi)有泡沫樣分泌物,氣管壁及喉壁出血、
充血(圖2)?!?/p>
2-3 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果
牛肺組織中培養(yǎng)獲得一種邊緣光滑、濕潤(rùn)、圓形
透明的菌落。革蘭氏染后,顯微鏡下觀察為革蘭
氏陰性短桿狀細(xì)菌.?dāng)U增該菌的16S?。颍遥危粒疁y(cè)序分
中固螞才?2011?2?科技
圖1 肺組織買變及壞死 圖2氣雷充血、出血。見大量泡沫
析后確定為大腸桿菌?!?/p>
2.4支原體的分離結(jié)果
對(duì)該樣品肺組織、喉拭子、氣管拭子等病料接
種液體及固體支原體培養(yǎng)基,接種喉拭子的平板上
出現(xiàn)典型的“煎蛋樣”外觀的菌落(圖3)。取培養(yǎng)的
支原體菌落進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增,獲得陽(yáng)性條帶,
略小于250bp,與理論值238bp相符(圖4)。進(jìn)一步
進(jìn)行16S?。颍遥危翜y(cè)序分析,確定為牛支原體?!?/p>
bD?。汀。薄。病?/p>
2000
1000
750
500
250
238
10O
圖3?。停猓铮觯椋蟮模校茫覕U(kuò)增結(jié)果 一 圖4喉拭子牛支原體
I:M.bovis擴(kuò)增產(chǎn)物:2:陰性對(duì)照: “煎蛋樣”外觀
M:DL?。玻埃埃啊。模危痢。停幔颍耄澹颉?/p>
2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果
藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,該牛場(chǎng)所感染的支原體較
敏感的抗菌藥為菌必冶、多黏菌素B及先鋒V;卡那
霉素、壯觀霉素、青霉素、氨芐等表現(xiàn)為中度敏感;
而常規(guī)抗生素對(duì)致病菌與支原體完全不敏感?!?/p>
3討論與結(jié)論
3.1 牛支原體是感染牛的一種非常重要但又容易
被忽視的病原,可以導(dǎo)致犢牛生長(zhǎng)緩慢,成年?!?/p>
泌量降低或引起多個(gè)器官的炎癥問。牛支原體大
都與巴氏桿菌、金黃葡萄球菌、化膿鏈球菌等感
染相伴發(fā):另外,牛支原體可與呼吸道合胞體病毒、
傳染性鼻氣管炎病毒或牛病毒性腹瀉病毒伴發(fā)。在英
國(guó)所調(diào)查中的55個(gè)牛場(chǎng)中,有半數(shù)牛場(chǎng)檢測(cè)到牛支
原體特異性抗體,但是僅7個(gè)牛場(chǎng)檢測(cè)到呼吸道合胞
體病毒、鼻氣管炎病毒或牛病毒性腹瀉病毒抗體 ?!?/p>
瑞士牛支原體導(dǎo)致的呼吸道疾病占牛全部呼吸道
卞圈碼斗?2011?2?科技
疾病的50%I61。在所有牛呼吸系統(tǒng)病原的混合感染
中.牛支原體的感染居于首位 ,91?!?/p>
?3?
支原體?。U衔覈?guó)養(yǎng)牛業(yè)的健康快速發(fā)展?!?/p>
參考文獻(xiàn)
3.2在牛支原體病治療藥物的選擇上,由于不同?!?/p>
場(chǎng)病?;疾∏闆r、病程、混合感染或繼發(fā)感染情況
[1】Nicholas R?。?,Ayling?。摇。摹。停悖铮穑欤幔螅恚帷。猓铮觯椋螅海洌椋螅澹幔螅?,diagnosis?。幔睿洌ǎ铮睿簦颍铮臁?/p>
[J1.Res Vet?。樱澹?,2003,74(2):105一l12.
【2]石磊,龔瑞,尹爭(zhēng)艷,等.肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的初步診斷lJ_.華
中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,27(4):572 各異,很難確定一個(gè)統(tǒng)一的治療方案。石磊等通過(guò)
藥敏試驗(yàn)證實(shí)環(huán)丙沙星等藥物對(duì)部分支原體菌株
敏感131,另有報(bào)道認(rèn)為早期使用泰樂菌素類藥物或
土霉素也有一定效果 ”。堅(jiān)持早診斷、早治療,把握
動(dòng)物臨床用藥原則、嚴(yán)格用藥量及用藥療程、不濫
[3】石磊,龔瑞,尹爭(zhēng)艷,等.肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的診斷【Jll華c 農(nóng)
業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,27(51:629—633.
f41中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì).中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)
準(zhǔn)——牛傳染性胸膜肺炎(牛肺疫)診斷技術(shù)GB/TI864922002[S].北京:
中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2002.
【5]中華人民共和圍衛(wèi)生部醫(yī)政司全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程lM].南京:東南
大學(xué)出版社,2006. 用抗生素,可以在一定程度上控制牛支原體肺炎?,F(xiàn)
階段尚無(wú)有效的牛支原體疫苗,研究證實(shí),牛支原
體病通常在牛饑餓、寒冷、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激狀態(tài)下
更易發(fā)生 ,避免牛的長(zhǎng)途運(yùn)輸、切實(shí)改善飼養(yǎng)環(huán)境
和營(yíng)養(yǎng)條件,提高牛的抗病力,是預(yù)防牛患支原
【6?。校铮酰恚幔颍叮剩幔簟。?,Le Grand?。模校瑁椋欤椋穑穑濉。樱澹簟。幔保牛妫妫椋悖幔悖。铮妗。螅穑澹悖簦椋睿铮恚悖椋睢。幔纾幔椋睿螅簟?/p>
Mycoplasma?。猓铮觯椋蟆。椋睿洌酰悖澹洹。穑睿澹酰恚铮睿椋帷。椋睢。悖铮睿觯澹睿簦椋铮睿幔欤欤。颍澹幔颍澹洹。悖幔欤觯澹蟆荆剩辍。?/p>
Vet?。停椋悖颍铮猓椋?,2o01,80(1a):23—35.
[7】?。拢酰悖瑁觯幔颍铮觯帷。?,Vesselinova?。粒希睢。簦瑁濉。幔澹簦椋铮穑幔簦猓铮纾澹睿澹螅椋蟆。铮妗。停悖铮穑欤幔螅欤帷?/p>
pneumonia?。椋睢。悖幔欤觯澹螅郏剩荩粒颍悖琛。牛稹。郑澹簦澹颍椋睿幔颍恚澹洌保梗福?,43(5):685—689.
[8】?。危椋悖瑁铮欤幔蟆。摇。痢。剩薄。祝铮铮洹。?,Baker S,et?。幔保停悖铮穑欤幔螅恚幔蟆。椋螅铮欤幔簦澹洹。妫颍铮怼?/p>
ruminants?。椋睢。拢颍椋簦幔椋睢。保梗梗担玻埃埃埃校铮觯澹洌帷。省。拢疲澹颍睿幔睿洌澹。粒疲颍澹。?,et al?。?/p>
Mycoplasmas of?。颍酰恚椋睿幔睿簦螅海穑幔簦瑁铮纾澹睿椋悖椋簦?,diagnostics,epidemiology?。幔睿洹?/p>
體病的關(guān)鍵所在。
牛支原體病是嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的傳染性疾病,
molecular?。纾澹睿澹簦椋悖螅郏茫荩拢颍酰螅螅澹欤螅海牛酰颍铮穑澹幔睢。茫铮恚恚椋螅螅椋铮睿玻埃埃保海薄。保叮保玻埃?/p>
【9]冉智光,謝建華,駱璐,等.我國(guó)部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體
診斷fJ1.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).2010,32(1):40—43.
【10】康云.肉牛支原體肺炎的診斷?。校危桑剩桑竽痢~F醫(yī).2010,29(1):130.
本文是我國(guó)牛支原體導(dǎo)致奶牛支原體肺炎的首次
報(bào)道?,F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外缺乏有效的防治牛支原體的方法,
亟需加強(qiáng)牛支原體免疫原性、致病機(jī)制等方面的研
究,積極開發(fā)有效的診斷試劑及疫苗,有效防控?!?/p>
[11】Caswell?。省。?,Archambault M.Myeoplasma?。猓铮颍椋蟆。穑睿澹酰恚铮睿椋帷。椋睢。悖幔簦簦欤濉?/p>
Ania?。簦龋澹幔欤簦琛。遥澹蟆。遥澹觯玻埃埃?,8(2):16l—l?。福丁?/p>
A?。茫幔螅濉。遥澹穑铮颍簟。妫铮颉。停悖铮穑欤幔螅恚帷。拢铮觯椋蟆。校睿澹酰恚铮睿椋帷。椋睢。模幔椋颍。茫铮鳎蟆?/p>
HU Chang-min”,PENG?。眩椋睿纾辏椋濉?,CHEN Ying—yu 。。,BA?。兀椋幔铩欤椋幔睿纭?。,BAI?。冢瑁椤洌椤。牵眨稀。粒椤瑁澹睢?。
(1.College?。铮妗。郑澹簦澹颍椋睿幔颍。停澹洌椋悖椋睿?,Huazhong Agricultural?。眨睿椋觯澹颍螅椋簦?,Wuhan 430070;2.The?。樱簦幔簦澹洹。耍澹。蹋幔猓铮颍幔簦铮颍。铮妗。粒纾颍椋悖酰欤簦酰颍幔臁?/p>
Microbiology,Wuhan?。矗常埃埃罚埃唬常危幔簦椋铮睿幔臁。猓澹澹妗。茫幔簦簦欤濉。桑睿洌酰螅簦颍椋幔臁。裕澹悖瑁睿铮欤铮纾。樱螅簦澹?,Wuhan?。矗常埃埃罚埃?/p>
Abstract:Mycoplasma boris?。椋蟆。幔睢。椋恚穑铮幔睿簟。穑幔簦瑁铮纾澹睢。悖幔酰螅椋睿纭。纾颍澹幔簟。欤铮螅蟆。椋睢。悖幔簦簦欤濉。椋睿洌酰螅簦颍樱椋睿悖濉。玻埃埃浮。鳎瑁澹睢。停猓铮觯椋蟆。穑睿澹酰恚铮睿椋帷。椋睢?/p>
beef?。鳎幔蟆。妫椋颍螅簦欤。颍澹穑铮妫欤澹洹。椋睢。茫瑁椋睿幔簦瑁椋蟆。洌椋螅澹幔螅濉。鳎幔蟆。恚幔椋睿欤。洌椋螅悖铮觯澹颍澹洹。椋睢。猓澹澹妗。悖幔簦簦欤澹桑睢。簦瑁椋蟆。穑幔穑澹?,the?。洌幔椋。悖幔簦颍簦欤濉。幔妫簦澹颉。颍澹悖澹睿簟?/p>
transportation?。鳎幔蟆。椋欤臁。幔睿洹。瑁幔洹。螅椋恚椋欤幔颉。螅恚穑簦铮怼。簦铩。猓铮觯椋蟆。穑睿澹酰恚铮睿椋幔裕瑁濉。穑幔簦瑁铮纾澹睢。椋洌澹睿簦椋椋悖幔簦椋妫铮睢。鳎幔蟆。穑澹颍妫铮颍恚澹洹。猓。悖酰欤簦酰颍澹校茫摇?/p>
boris.?。幔睿洹。薄。叮印。颍遥危粒裕瑁濉。颍澹螅酰欤簦蟆。洌澹恚铮睿螅簦颍幔簦澹洹。簦瑁幔簟。簦瑁濉。洌椋螅澹幔螅濉。鳎幔蟆。悖幔酰螅澹洹。猓?/p>
Key words:Mycoplasma?。猓铮觯椋螅唬模幔椋。悖幔簦颍簦欤?;Infection;Respiratory?。洌椋螅澹幔螅澹蟆?/p>
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