CRISPR-Cas9是一種革命性的工具，部分原因在于其多功能性：由細(xì)菌產(chǎn)生的咀嚼病毒，它在人體細(xì)胞中同樣有效地進(jìn)行各種遺傳技巧，包括切割和粘貼DNA，制造精確突變以及激活或滅活一個(gè)基因。加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的研究人員現(xiàn)在通過提供“開啟”開關(guān)使其更加通用，允許用戶在除指定目標(biāo)之外的所有細(xì)胞中保持Cas9基因編輯器關(guān)閉。

經(jīng)過重新設(shè)計(jì)的Cas9酶 - 研究人員稱之為ProCas9 - 除了含有一定長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)外需要在酶結(jié)合并切割DNA之前進(jìn)行剪切。如果科學(xué)家插入一小段蛋白質(zhì)，只能通過特定的酶切割，例如癌細(xì)胞或感染性病毒或細(xì)菌專用的酶，那么該酶就會(huì)成為開啟Cas9的觸發(fā)因素。

ProCas9基本上“感知”它所基于蛋白質(zhì)切割酶的細(xì)胞類型 - 一種所謂的蛋白酶存在。

加州大學(xué)伯克利分校和分子細(xì)胞生物學(xué)副教授大衛(wèi)薩維奇說：“這是一個(gè)額外的安全層，可以放在分子上以確保準(zhǔn)確切割。”

除了可編程輸出外，它還賦予Cas9蛋白可編程輸入。

“有很多蛋白酶調(diào)節(jié)細(xì)胞中的信號(hào)通路，將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，并參與病原體感染，”Savage說。“如果我們能夠感知到這些信號(hào)，我們就可以利用這些重要途徑并做出相應(yīng)的反應(yīng)。”

在該研究中，Savage及其同事通過使Cas9對(duì)植物和人類病毒(如西尼羅河病毒)敏感，證明了Cas9的蛋白酶控制。在未來，他們相信這種技術(shù)可用于將CRISPR-Cas9細(xì)菌免疫系統(tǒng)導(dǎo)入植物中，以幫助它們抵御有害的病毒病原體。

來自加州大學(xué)伯克利分校和舊金山格拉德斯通研究所的研究人員的研究將于1月10日在線發(fā)表在Cell雜志上。

剝離Cas9的必需品

Savage最初的研究目標(biāo)是削減Cas9蛋白質(zhì) - 實(shí)際上是剪切DNA進(jìn)行基因編輯的“剪刀” - 最簡(jiǎn)單的部分，以獲得最強(qiáng)大的基因編輯器。它越簡(jiǎn)單，就越容易使用并運(yùn)送到細(xì)胞中。

“我們知道Cas蛋白質(zhì)是復(fù)雜的，它們具有各種調(diào)節(jié)作用，這對(duì)于它們?nèi)绾卧诩?xì)菌免疫系統(tǒng)中起作用至關(guān)重要，”他說。“我們工作的主要目標(biāo)是馴服它們以供人類使用，并去掉與基因組編輯無關(guān)的不必要的東西。”

特別是，他想重新設(shè)計(jì)Cas9，以便更容易附加其他蛋白質(zhì)。這將允許Cas9將具有多種功能的蛋白質(zhì)攜帶到DNA上的正確位置。這些被稱為融合蛋白，其有希望的變體可以改變基因表達(dá)，或者在稱為堿基編輯的技術(shù)的情況下，以精確的準(zhǔn)確度改變DNA中的一個(gè)堿基或核苷酸。

他用來重新設(shè)計(jì)Cas9的技術(shù)，稱為圓形排列，從未嘗試過像Cas9那樣復(fù)雜的蛋白質(zhì)。循環(huán)置換包括取Cas9蛋白的氨基酸串并切割它，切換兩個(gè)片段的順序，然后允許它折疊成新的3-D配置。他這樣做是為了將蛋白質(zhì)分成兩部分。

雖然您可能認(rèn)為這會(huì)完全破壞蛋白質(zhì)，但在大約10%的情況下，新蛋白質(zhì)仍然起作用，就像他只是以不同的方式重新排列蛋白質(zhì)的亞基而不影響它們的功能。這可能有效，因?yàn)檎鏑RISPR-Cas9發(fā)明人Jennifer Doudna和她的同事們所表明的那樣，Cas9蛋白復(fù)合物具有高度的靈活性，當(dāng)它抓到引導(dǎo)RNA上時(shí)會(huì)移動(dòng)，與DNA結(jié)合并移動(dòng)到切割DNA鏈的位置。

Savage目前正在探索一些Cas9重排，這些重排可能為融合蛋白提供更好的支架，使它們更接近它們靶向的DNA鏈。

在重新安排Cas9支架的過程中，他偶然發(fā)現(xiàn)，他重新連接兩個(gè)蛋白質(zhì)片段的方式有所不同。“當(dāng)我們切割蛋白質(zhì)并將舊片段移到蛋白質(zhì)中的新位置時(shí)，系統(tǒng)對(duì)于將兩個(gè)片段連接在一起的方式變得非常敏感，”他說。“我們意識(shí)到我們可以利用這種敏感性來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)以獲得蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。”

該研究表明，“我們并沒有堅(jiān)持大自然賦予我們的基因組編輯蛋白質(zhì)，”他說。“這些蛋白質(zhì)可以精心優(yōu)化，變成自然界中沒有的支架，但具有適用于人體細(xì)胞的特性。”