熒光：

1．熒光產(chǎn)生的機(jī)理是什么？

P233

（一）熒光的產(chǎn)生

(1)分子的能量狀態(tài)

在光學(xué)分析中涉及的分子能級：

Eo=Ee+Ev+Er

Ee：價電子運(yùn)動能（電子能級）,electron

Ev：原子在平衡位置附近的振動（震動能級）,vibration

Er：分子繞其重心的轉(zhuǎn)動能（轉(zhuǎn)動能級）,rotation

其中?Ee>?Ev>?Er

(2)分子的能級EnergyLevels與躍遷Transition

2．熒光技術(shù)研究的生物學(xué)樣品的主要參數(shù)有哪些？量子產(chǎn)率與熒光強(qiáng)度的區(qū)別及關(guān)系是

什么？熒光偏振的意義是什么？

P234-237

熒光分光光度術(shù)中的參量：

(1)熒光光譜及主要譜參量

熒光光譜包括：鏡像對稱。

激發(fā)光譜(excitatipectrum)(波長：?ex——最大激發(fā)波長)；

發(fā)射光譜(emissipectrum)(波長：?em,?max——最大發(fā)射波長)。

(2)熒光強(qiáng)度(fluorescenceintensity,F,I)與量子產(chǎn)率(quantumyield,?)

A．熒光強(qiáng)度的定義：在一定激發(fā)波長(λex)作用下，發(fā)射的熒光強(qiáng)弱。由于發(fā)射的熒光為

一光譜，所以發(fā)射的熒光強(qiáng)度常常是指發(fā)射某一波長的熒光。測得的F不是光能量的絕對

值大小或光子數(shù)，而是在一定的儀器條件下測得的一種相對強(qiáng)度。

B．?=發(fā)射光子數(shù)/吸收光子數(shù)。表示某種物質(zhì)的發(fā)光本領(lǐng)。任何物質(zhì)的?不會大于1，且同

一物質(zhì)在不同的環(huán)境下，?不同。

εεF=?Ia，Ia=I

0

-I，I=I

0

10-cL→F=?I

0

(1-10-cL)→

→當(dāng)C很低時F=?I

0

εcL→F與C成正比；

→當(dāng)C較大時F=I

0

?→F與C無關(guān)。

(3)熒光偏振(fluorescencepolarization)

熒光偏振度Fluorescencepolarization--P=(I

//

-I

?

)/(I

//

+I

?

)

熒光各向異性Fluorescenceanisotropy--A=(I

//

-I

?

)/(I

//

+2I

?

)

熒光偏振度的物理意義：

A：I

//

=I

?

，P=0，自然光，熒光分子運(yùn)動很快，取向隨機(jī)。（稀溶液）

B：I

//

或I

?

為0，P=±1，偏振光，熒光分子運(yùn)動很慢，取向有序。

C：I

//

?I

?

?0，0

(4)熒光壽命(fluorescencelifetime--?)

熒光衰減為原來激發(fā)時最大熒光強(qiáng)度的1/e所需要的時間。

I=I

0

e-kt，?=1/k

(5)熒光探針(fluorescenceprobe)

具有環(huán)狀共軛雙鍵即π電子系統(tǒng)；

量子產(chǎn)率隨環(huán)境變化，而且變化很大；

能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光的小分子；

藻膽蛋白phycobiliprotein

綠熒光蛋白GreenFluorescentProtein

與研究對象的特定基團(tuán)共價結(jié)合或與蛋白質(zhì)非共價結(jié)合。

3．舉例說明熒光技術(shù)的應(yīng)用？

P239-244

4．如果嬰幼兒體內(nèi)缺乏使苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼岬拿笗r，則苯丙氨酸的含量異常增大而患

“苯丙酮尿癥”且易引起智力低下，所以，對嬰幼兒的該項體查極為重要，但是，由于血

液蛋白質(zhì)中其它芳香氨基酸的影響而難以測出苯丙氨酸的含量，請用本課程所學(xué)內(nèi)容提

出一個檢測方案。

P239下-240上

NMR

1題：NMR中外加磁場的作用?

為了使自旋核產(chǎn)生能級分裂而對電磁波產(chǎn)生共振吸收。

2題：.NMR中提高外加磁場的強(qiáng)度的作用?

書247頁18－2下邊一段，提高外加磁場，增大能級差，以增加分辨率；抵消電子的屏蔽作

用。為了滿足共振條件：?=?H0，即可引起原子核兩個能級間的躍遷。共振條件的推導(dǎo)在前

兩頁。

3題：NMR中如何區(qū)分化學(xué)位移和J偶合?

理論上講，同種原子核處于同樣的磁場中能級裂分，接受射頻時應(yīng)該在同一位置發(fā)生共

振。不同基團(tuán)中的同種核，因屏蔽不同,造成共振峰位不同，從而產(chǎn)生不同的化學(xué)位移。詳

見p248。

J耦合是核與核之間以價電子為媒介相互耦合引起譜線分裂的現(xiàn)象，即自旋裂分，見248

頁。

化學(xué)位移與場強(qiáng)有關(guān)，J耦合與場強(qiáng)無關(guān)，由基團(tuán)之間的自旋相互作用引起。通過調(diào)節(jié)

分辨率可以區(qū)分，提高分辨率才會出現(xiàn)的是J耦合。具體見書248、249頁。

4題：如何理解NMR中峰寬?

249頁第二段，表示物質(zhì)的量。

蛋白質(zhì)折疊：

1.蛋白質(zhì)折疊中的”中心法則”？

生物物理書P22

中心法則：序列結(jié)構(gòu)功能

2.聯(lián)系生物物理技術(shù)部分所學(xué)內(nèi)容，哪些技術(shù)可以用來進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊研究，其根據(jù)是什

么？

生物物理書P22-P23

技術(shù)：CD：p227-228

紅外萊曼：p219

熒光：p240依據(jù)：極性對熒光的影響

Nmr：p251依據(jù)：化學(xué)位移

紅外光譜：

1．液態(tài)紅外光譜是否需要水作溶劑?為什么?

試樣中不應(yīng)含有游離水。在溶液中測定光譜時，由于溶劑的種類、溶劑的濃度和測定時

的溫度不同，同一種物質(zhì)所測得的光譜也不同。通常在極性溶劑中，溶質(zhì)分子的極性基團(tuán)的

伸縮振動頻率隨溶劑極性的增加而向低波數(shù)方向移動，并且強(qiáng)度增大。水本身有紅外吸收，

會嚴(yán)重干擾樣品譜，而且會侵蝕吸收池的鹽窗。因此，在紅外光譜測定中，應(yīng)盡量采用非極

性的溶劑。

2．線性分子的振動自由度為什么是3N-5?紅外光譜中是否能夠觀察到所有振動自由度對應(yīng)

的紅外吸收峰?為什么?

設(shè)分子由n個原子組成，每個原子在空間都有3個自由度，原子在空間的位置可以用直

角坐標(biāo)中的3個坐標(biāo)x、y、z表示，因此，n個原子組成的分子總共應(yīng)有3n個自由度，即

3n種運(yùn)動狀態(tài)。但在這3n種運(yùn)動狀態(tài)中，包括3個整個分子的質(zhì)心沿x、y、z方向平移運(yùn)

動和3個整個分子繞x、y、z軸的轉(zhuǎn)動運(yùn)動。這6種運(yùn)動都不是分子振動，因此，振動形式

應(yīng)有（3n-6）種。但對于直線型分子，若貫穿所有原子的軸是在x方向，則整個分子只能繞

y、z軸轉(zhuǎn)動，因此，直線性分子的振動形式為（3n-5）種。

每種簡正振動都有其特定的振動頻率，似乎都應(yīng)有相應(yīng)的紅外吸收帶。實際上，絕大多

數(shù)化合物在紅外光譜圖上出現(xiàn)的峰數(shù)遠(yuǎn)小于理論上計算的振動數(shù)，這是由如下原因引起的：

（1）沒有偶極矩變化的振動，不產(chǎn)生紅外吸收；

（2）相同頻率的振動吸收重疊，即簡并；

（3）儀器不能區(qū)別那些頻率十分接近的振動，或吸收帶很弱，儀器檢測不出；

（4）有些吸收帶落在儀器檢測范圍之外。

例如，線型分子二氧化碳在理論上計算其基本振動數(shù)為4，共有4個振動形式，在紅外

圖譜上有4個吸收峰。但在實際紅外圖譜中，只出現(xiàn)667cm-1和2349cm-1兩個基頻吸收

峰。這是因為對稱伸縮振動偶極矩變化為零，不產(chǎn)生吸收，而面內(nèi)變形和面外變形振動的吸

收頻率完全一樣，發(fā)生簡并。

基本振動吸收峰數(shù)少于振動自由度的原因：

(譜帶)簡并：不同振動形式的振動頻率相同，其吸收峰在紅外吸收光譜的同一位置出現(xiàn)。

紅外非活性振動：不能引起偶極矩變化(??=0)，不吸收紅外線的振動。

3．CO2的紅外光譜中能夠觀察到幾個紅外吸收峰?為什么?

兩個，一個是反對稱伸縮振動的吸收峰，一個是變形振動的吸收峰，本應(yīng)該有四個，但

對稱伸縮振動的偶極矩變化為零，不產(chǎn)生吸收；而變形振動包括面內(nèi)變形和面外變形，他們

的吸收頻率一樣，所以重合了。因此只有兩個吸收峰.變形：667cm-1伸縮：2369cm-1

4.拉曼光譜中為什么Stokes線的強(qiáng)度遠(yuǎn)大于反Stokes線?

S是從基態(tài)到激發(fā)態(tài)躍遷，而反S是有激發(fā)態(tài)到基態(tài)躍遷,反斯托克斯線的強(qiáng)度遠(yuǎn)小于

斯托克斯線的強(qiáng)度，這是由于Boltzmann分布，處于振動基態(tài)上的粒子數(shù)遠(yuǎn)大于處于振動激

發(fā)態(tài)上的粒子數(shù)。

CD

1WhenCDisappliedtoproteinswhatisthemainchromophore(absorbinggroup)thatislooked

at?Whatwavelengthrangedoesitabsorbin?當(dāng)元二光譜應(yīng)用于蛋白分析時，主要觀察哪個

吸收段？主要吸收哪個波段？

主要觀察紫外區(qū)段，160-300nm

2DoestheCDspectrumofaproteingivemostinformationaboutthe(i)primarystructure,(ii)

secondarystructureor(iii)tertiarystructure?元二光譜主要分析蛋白質(zhì)的什么信息？主要結(jié)

構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)，還是結(jié)構(gòu)？

二級結(jié)構(gòu)，分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是原二光譜的最基礎(chǔ)得應(yīng)用。

3DrawtheCDspectrumofanα-ertolabeltheaxesandmarkimportantpoints

withtheirvalues.畫出α螺旋的圖像，注意標(biāo)記軸和重要點的值。

[?]

x

-3E

0

200

21022023024

nm

黃線課本227左下也有

4WhyisnitrogengasusedinCDinstruments?氮氣在原二普中的作用？

氮氣保護(hù)裝置

5DoesCDgiveinformationaboutwherethehelicesareinaprotein?應(yīng)用原二普分析可以了

解蛋白質(zhì)的螺旋在哪嗎？

不能

false?Why?膜蛋白難以用原二普

分析，真還是假?為什么？

膜蛋白是近年來分子生物學(xué)研究的熱點，膜蛋白是一類具有晶體類似結(jié)構(gòu)的鑲嵌于細(xì)胞

膜上的蛋白，到目前為止，僅有為數(shù)不多的膜蛋白結(jié)構(gòu)得到確認(rèn)。研究表明，膜蛋白紫外電

子光譜躍遷受到周圍環(huán)境介電常數(shù)的影響，其原因可能是由于溶劑影響了電子由基態(tài)躍遷到

激發(fā)態(tài)（n→π*,π→π*）的躍遷能量。不同于溶液環(huán)境中的蛋白質(zhì)，膜蛋白鑲嵌于疏水

的脂質(zhì)環(huán)境之中，因此，膜蛋白紫外CD光譜可能跟溶液狀態(tài)下的CD信號有所區(qū)別。Wallace

等研究表明，以現(xiàn)有的未包括膜蛋白的參考蛋白體系，采用SELCON3、CONTIN及CDSSTR

等擬合運(yùn)算程序預(yù)測具有富含α-螺旋及β-折疊的膜蛋白，其結(jié)果與溶液狀態(tài)的蛋白CD光

譜有差別，特別在190nm后尤為明顯；并且溶液狀態(tài)的CD光譜擬合蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)果與由

DSSP方法計算的膜蛋白晶體二級結(jié)構(gòu)有差別。所以他們認(rèn)為，現(xiàn)有的溶液參考蛋白體系不

適合于CD擬合預(yù)測膜蛋白二級結(jié)構(gòu)，提倡建立新的含有膜蛋白的參考蛋白體系。

所以可以利用元二譜分析膜蛋白，但要新的參考系。

填空題I

1.脂雙層發(fā)生凝膠-液晶相轉(zhuǎn)變后，膜流動性增加運(yùn)動能力加強(qiáng)

2.由于細(xì)胞膜的跨膜電位為內(nèi)負(fù)外正所以帶負(fù)電荷的磷脂趨向分布于脂雙層

的內(nèi)側(cè)

3.X射線晶體學(xué)中，結(jié)構(gòu)因子F（S）的物理意義是晶胞中所有電子在方向s的散

射波與單個電子散射波振幅之比，其中含有分子中電子的空間分布?(r)的信息

電子密度p(r)可通過F（S）傅里葉變換獲得

4.蛋白質(zhì)跨膜時，肽鏈必須形成分子內(nèi)氫鍵并折疊（α螺旋或β折疊）以

增強(qiáng)疏水性減少極性

5.在功能筏中，分子的運(yùn)動能力比凝膠態(tài)強(qiáng)，比液晶態(tài)弱

填空題II

1元素周期表中的過渡金屬除鋅外均屬自由基是因為未配對電子

2自由基的化學(xué)活性主要源自孤電子可奪取或失去一個電子配成對

3試舉出一種穩(wěn)定的自由基并說明它的應(yīng)用

自旋標(biāo)記物（spinlabels）：第一個穩(wěn)定的化學(xué)自由基氮氧化物特點:

應(yīng)用舉例：

報告膜的流動性：將自旋標(biāo)記物加入到膜脂懸液中時，一部分標(biāo)記物進(jìn)入膜內(nèi)，另一部

分則留在液相，進(jìn)入膜內(nèi)的標(biāo)記物與留在液相的標(biāo)記物所鄰環(huán)境十分不同，二者的ESR譜

存在差異。

4試舉出自由基對膜脂損傷后膜脂分子常見的幾種變化（至少舉出兩種）

5許多過渡金屬的毒性都涉及到活性氧的產(chǎn)生，過渡金屬的這一毒性源自

Fenton氏反應(yīng)

6硫氧環(huán)蛋白還原酶的濃度水平常被用來衡量集體的抗氧化應(yīng)激能力是因為

幾乎所有形式的ROS都可以氧化Met為MetO，進(jìn)而消耗硫氧還蛋白，而Msr可

以把氧化型硫氧還蛋白還原為有活性的硫氧還蛋白

7乙酰膽堿與徐緩激肽對血管舒張作用依賴血管內(nèi)皮的原因是

其本身無擴(kuò)血管作用，而需要作用于內(nèi)皮細(xì)胞使其產(chǎn)生NO

8用ESR自旋標(biāo)記技術(shù)測定非順磁生物大分子的運(yùn)動情況所依據(jù)的主要兩點是

答案待定：要考就胡逼答吧！！

1.自旋標(biāo)記技術(shù)（將某些含孤電子的物質(zhì)——自旋標(biāo)記物（spinlabels）

連接或摻入到那些本身不具有不成對電子的物質(zhì)體系中，所紀(jì)錄到的自旋標(biāo)記物

的ESR譜能反映與其連接或臨近的本身不具有不成對電子的物質(zhì)體系的某些性

質(zhì)，使得本身不具有不成對電子的物質(zhì)體系也可用順磁共振技術(shù)研究現(xiàn)象，此即

為自旋標(biāo)記技術(shù)。許多重要的生物大分子如脂、糖、蛋白等本身并不含有順磁中

心，正是依靠自旋標(biāo)記技術(shù)，才能夠用EPR進(jìn)行研究獲得了關(guān)于生物大分子結(jié)構(gòu)、

功能等很多信息。自旋標(biāo)記技術(shù)極大地擴(kuò)展了EPR技術(shù)的應(yīng)用范圍，為EPR技術(shù)

的發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)）

2.不知道答自由基捕獲行不?

簡答題

簡述生物大分子的熒光發(fā)光機(jī)理及影響熒光強(qiáng)度的因素?zé)晒馍鷪F(tuán)+P232

研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的常用方法有哪些？對于一個結(jié)構(gòu)位未知的蛋白質(zhì)，請用生

物物理學(xué)知識設(shè)計一個實驗，研究其二級結(jié)構(gòu)，并敘述實驗原理P13

試述呼吸爆發(fā)的殺菌機(jī)制P143

核磁共振的基本原理是什么？為了提高核磁共振分辨率，可以通過提高核磁共振

中外加磁場強(qiáng)度的方法而實現(xiàn)，為什么？P245+思考題

目前認(rèn)為大腦中蛋白質(zhì)A貝塔蛋白的聚集是引起老年癡呆的主要原因之一，請應(yīng)

用本學(xué)期所學(xué)生物物理學(xué)知識并從蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的角度設(shè)計一個體外研究方

案，研究某種藥物對老年癡呆是否有一定的治療作用CD紅外蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

變化

一種雙鏈磷脂的鏈長為2nm，每條鏈的直徑為0.40nm；該磷脂的頭部截面積為

0.50nm2.請用計算說明：該種磷脂與水混合后，以何種聚集狀態(tài)存在P53

大題：

1.脂質(zhì)過氧化P155-156

2.計算磷脂分子聚集體狀態(tài)應(yīng)用公式s=v/alP53

3.蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)及其意義P21

4.蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的測定方法，簡要介紹其中一種的原理P13

5.生物大分子發(fā)生熒光的原理及影響熒光測量的因素?zé)晒馍鷪F(tuán)+P232

6.熒光共振能量轉(zhuǎn)移的三個條件及其應(yīng)用課件+P241-242