藥物開發(fā)餡餅相當(dāng)大的切片是針對(duì)蛋白質(zhì)的練習(xí)。找到一個(gè)有問(wèn)題的蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)或口袋，小分子中的東西干擾該蛋白質(zhì)的功能，如果一切順利，則治療由該功能失常的大分子引起的疾病。

但只有大約15%的蛋白質(zhì)具有這樣一個(gè)方便的口袋或活性位點(diǎn)，導(dǎo)致其余的被認(rèn)為是“不可遏制的”。一些研究人員和藥物開發(fā)人員意識(shí)到該解決方案可能是針對(duì)RNA水平的疾病相關(guān)蛋白(參見(jiàn)“科學(xué)家們利用小分子藥物瞄準(zhǔn)導(dǎo)致疾病的RNAs”，“科學(xué)家”，2019年4月)。

信使RNA是一個(gè)明顯的目標(biāo)，因?yàn)樗鼈兙幋a蛋白質(zhì)，甚至直接干擾某些疾病中的細(xì)胞過(guò)程。但其他RNA在一些藥物開發(fā)商的視線中：非編碼RNA，如調(diào)節(jié)基因表達(dá)的microRNA，也可能值得改變。畢竟，只有1%到2%的人類基因組被翻譯成蛋白質(zhì)，而大約四分之三被轉(zhuǎn)錄成RNA(PNAS，104：19428-33,2007)。

“由于具有靶向RNA的能力，你將極大地?cái)U(kuò)大潛在的藥物靶標(biāo)庫(kù)，”馬薩諸塞州劍橋市諾華生物醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)科學(xué)部罕見(jiàn)疾病負(fù)責(zé)人Rajeev Sivasankaran說(shuō)。

正在開發(fā)的一種選擇是使用反義寡核苷酸(ASO)，與靶RNA結(jié)合的短核酸序列并阻斷它們或加速它們的降解。但這些大分子不易到達(dá)大腦和脊髓，它們會(huì)導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)下降，導(dǎo)致出血問(wèn)題。

相比之下，小分子是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的候選藥物。RNA靶向藥物是不尋常的，但并非不可能：例如，某些抗生素對(duì)細(xì)菌核糖體RNA起作用。結(jié)合RNA上的功能位點(diǎn)的小分子可以防止與核糖體或其他結(jié)合配偶體的相互作用?；蛘咝》肿涌赡艽龠M(jìn)RNA靶標(biāo)的切割和破壞?？茖W(xué)家們正在應(yīng)用高通量篩選和合理設(shè)計(jì)方法來(lái)鑒定將影響RNA生物學(xué)的分子。在這里，The Scientist調(diào)查了一些關(guān)鍵技術(shù)，使RNA成為藥物開發(fā)中的下一個(gè)重點(diǎn)。

覺(jué)形狀

了解RNA結(jié)構(gòu)可以幫助科學(xué)家在藥物可能結(jié)合的核酸上找到口袋。北卡羅來(lái)納大學(xué)教堂山分校的化學(xué)家，以及開發(fā)RNA靶向藥物的公司Ribometrix的聯(lián)合創(chuàng)始人Kevin Weeks表示，一些RNA結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一樣復(fù)雜。堿基配對(duì)導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)，RNA形成發(fā)夾和螺旋。它們可以一起折疊成更復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)，例如假結(jié)和多螺旋結(jié)。

Weeks設(shè)計(jì)了一種易于使用的技術(shù)，稱為SHAPE(通過(guò)引物延伸分析“選擇性2'-羥基?；?rdquo;的簡(jiǎn)稱)來(lái)探測(cè)RNA結(jié)構(gòu)(J Am Chem Soc，127：4223-31,2005;Nat Methods，11： 959-65,2014)。SHAPE識(shí)別RNA的哪些部分是松散的并且能夠與試劑相互作用，并且哪些部分結(jié)合在阻止這種相互作用的結(jié)構(gòu)中。

憑借靶向RNA的能力，您將大大擴(kuò)展?jié)撛诘乃幬锇袠?biāo)庫(kù)。

-Rajeev Sivasankaran，

諾華生物醫(yī)學(xué)研究所

在這種情況下，試劑是一組化學(xué)物質(zhì)中的一種，其可以潛在地附著于四種RNA核苷酸A，U，G和C中的任何一種，用所謂的2'-O-加合物標(biāo)記每種。關(guān)鍵的訣竅是：“它只能在一些搖擺或構(gòu)象靈活的核苷酸上與RNA反應(yīng)，”Weeks說(shuō)。例如，在RNA發(fā)夾中，沿著針長(zhǎng)度的堿基配對(duì)核苷酸將受到保護(hù)，但是核苷酸游離的末端的環(huán)可以被試劑修飾。

結(jié)果是RNA分子，其中某些堿基用加合物標(biāo)記，而其他堿基未標(biāo)記。然后，Weeks和他的團(tuán)隊(duì)使用逆轉(zhuǎn)錄酶制作該RNA的DNA拷貝。當(dāng)酶沿RNA傳播時(shí)，它會(huì)與標(biāo)記的堿基形成錯(cuò)誤，從而產(chǎn)生錯(cuò)配的核苷酸。當(dāng)科學(xué)家對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序時(shí)，這些錯(cuò)誤會(huì)顯示為突變，并指向原始RNA未被結(jié)合的位置。

研究人員可以將他們的序列輸入軟件，可以在Weeks的網(wǎng)站上免費(fèi)獲得，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。Weeks表示，它“非?？煽?，但不是100%完美”。該技術(shù)適用于試管和內(nèi)部細(xì)胞。

直接到屏幕

在最近的高通量篩選中，Novartis偶然發(fā)現(xiàn)了與RNA和剪接體結(jié)合的小分子，以減輕與脊髓性肌萎縮相關(guān)的剪接缺陷(Nat Chem Biol，11：511-17,2015)。然而，那些研究人員并沒(méi)有專門尋找RNA結(jié)合物。密歇根大學(xué)安娜堡分校的化學(xué)生物學(xué)家Amanda Garner從一開始就設(shè)計(jì)了一個(gè)針對(duì)RNA的屏幕。具體來(lái)說(shuō)，她是在結(jié)合微小RNA的小分子之后。

她的方法是ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)的變體，其使用抗體來(lái)檢測(cè)肽或蛋白質(zhì)。它被稱為催化酶連接的點(diǎn)擊化學(xué)測(cè)定，或cat-ELCCA(Chem Commun，52：8267-70,2016)。該測(cè)定法檢測(cè)干擾發(fā)夾形pre-miRNA成熟為功能性microRNA的小分子。

第一步是將感興趣的pre-miRNA與分子標(biāo)記連接起來(lái)，使其在以后可檢測(cè)到。在發(fā)夾頂部的環(huán)路上，Garner附著一個(gè)叫做TCO(反式環(huán)辛烯)的8碳環(huán)。她將這些標(biāo)記的pre-miRNA固定在384孔板的底部。然后，她從化學(xué)庫(kù)中添加了不同的化合物，使他們有機(jī)會(huì)結(jié)合miRNA。之后，她補(bǔ)充了Dicer，這種酶負(fù)責(zé)切割pre-miRNA以使它們活躍。

Dicer切割任何未被小分子束縛的發(fā)夾，切斷TCO。然而，附著在小分子上的miRNA受到Dicer刀片的保護(hù)。最后，加納添加了與四嗪結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶，四嗪可與TCO結(jié)合。僅存在于未切割的miRNA上的過(guò)氧化物酶的活性可以用化學(xué)發(fā)光測(cè)定法檢測(cè)，并且用平板讀數(shù)器鑒定發(fā)光孔。任何發(fā)光的井都是潛在的打擊。

在最近的一項(xiàng)研究中，Garner使用cat-ELCCA篩選阻斷pre-miRNA切割miR-21的化合物，miR-21是一種在大多數(shù)癌癥中過(guò)表達(dá)的microRNA。在大約83,000個(gè)小分子和天然產(chǎn)物中，她報(bào)告了1,819次點(diǎn)擊，其中217次在一式三份測(cè)試后得到確認(rèn)。

一個(gè)小分子結(jié)合感興趣的RNA是不夠的;它還必須忽略細(xì)胞中的所有其他RNA。為了開始解決這種特異性，Garner及其同事檢查了他們的miR-21結(jié)合物與對(duì)照pre-microRNA的相互作用，稱為pre-let7-d。一些天然提取物對(duì)miR-21具有選擇性，Garner與合作者一起確定了一種純化合物，可能是最終抗癌藥物的候選物。(SLAS Discov，23：47-54,2018)。

設(shè)計(jì)師藥物

不是每個(gè)人都可以訪問(wèn)大型化學(xué)庫(kù)。佛羅里達(dá)州朱庇特斯克里普斯研究所的化學(xué)生物學(xué)家馬特迪斯尼指出，大多數(shù)小分子文庫(kù)的設(shè)計(jì)都考慮了蛋白質(zhì)靶標(biāo)，他是Expansion Therapeutics的聯(lián)合創(chuàng)始人，該公司是一家針對(duì)病理擴(kuò)展的RNA重復(fù)序列的藥物開發(fā)公司。也就是說(shuō)，最適合靶向蛋白質(zhì)的參數(shù)可能不適用于RNA。例如，RNA結(jié)合劑可能不需要相同的嚴(yán)格分子量標(biāo)準(zhǔn) - 通常小于500道爾頓 - 用于蛋白質(zhì)靶向藥物。

迪士尼采用合理的設(shè)計(jì)方法來(lái)靶向RNA。他的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了一條管道來(lái)識(shí)別和利用RNA和小分子之間有希望的相互作用(J Am Chem Soc，doi：10.1021 / jacs.8b13419,2019)。

它從二維組合篩選或2DCS開始(J Am Chem Soc，130：11185-94,2008)。迪士尼的想法是將兩個(gè)文庫(kù) - 一個(gè)不同的RNA結(jié)構(gòu) - 另一個(gè)小分子 - 通過(guò)將微小分子附加在微陣列中，并將它們暴露于數(shù)萬(wàn)個(gè)RNA基序的混合物中。RNA用熒光或放射性化合物標(biāo)記，因此每次命中，定義為小分子和RNA基序之間的成功結(jié)合，在微陣列上產(chǎn)生可檢測(cè)的斑點(diǎn)。研究人員切除這些命中并使用RNA測(cè)序來(lái)識(shí)別它們。

接下來(lái)是數(shù)據(jù)處理。迪士尼集團(tuán)開發(fā)了一項(xiàng)名為HiT-StARTS的統(tǒng)計(jì)程序，通過(guò)測(cè)序?qū)崿F(xiàn)高通量結(jié)構(gòu) - 活動(dòng)關(guān)系?；旧希琀iT-StARTS壓縮數(shù)據(jù)以評(píng)估每個(gè)RNA基序 - 小分子對(duì)之間的相對(duì)親和力(ACS Cent Sci，3：205-16,2017)。

研究人員隨后將這些數(shù)據(jù)和RNA序列輸入其數(shù)據(jù)庫(kù)Inforna，該數(shù)據(jù)庫(kù)可在迪士尼的網(wǎng)站上獲取(Nat Chem Biol，10：291-97,2014)。該數(shù)據(jù)庫(kù)目前包括約40,000個(gè)RNA-小分子相互作用，并定期更新。Inforna挖掘數(shù)據(jù)庫(kù)以找出最佳的RNA-小分子相互作用。

Inforna指出了幾種潛在的可藥用RNA。研究人員也可以考慮到特定的RNA來(lái)到Inforna，并尋找可能的結(jié)合口袋和小分子。

例如，Scripps團(tuán)隊(duì)使用Inforna來(lái)識(shí)別潛在的強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良的先導(dǎo)化合物，這是一種以肌肉僵硬為特征的成人肌肉萎縮疾病。它是由基因DMPK中重復(fù)序列的失控?cái)U(kuò)增引起的，導(dǎo)致mRNA連續(xù)存在數(shù)百或數(shù)千個(gè)CUG。這種擴(kuò)增的RNA粘附于剪接因子，干擾其他mRNA的加工。

擴(kuò)展后的RNA自身翻倍，與C和G的基礎(chǔ)配對(duì)形成一系列連接，U的伸出。迪士尼的團(tuán)隊(duì)使用Inforna來(lái)設(shè)計(jì)與這種異常鏈結(jié)合的小分子，而不是正常長(zhǎng)度的DMPK轉(zhuǎn)錄本，它們不構(gòu)成這種結(jié)構(gòu)。然后，對(duì)于這些化合物中的一種，它們附著核酸裂解抗生素和抗腫瘤劑博來(lái)霉素。被稱為Cugamycin的組合發(fā)現(xiàn)并切斷異常RNA(Nat Chem Biol，13：188-93,2017)。當(dāng)注射到肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良的小鼠模型中時(shí)，Cugamycin使大多數(shù)與疾病相關(guān)的RNA錯(cuò)誤剪接事件正?；⒔档图∪鈴?qiáng)度。

體內(nèi)驗(yàn)證

在試管中結(jié)合RNA的先導(dǎo)化合物在細(xì)胞中可能不會(huì)以相同的方式起作用，因此驗(yàn)證活體材料中的小分子作用以及檢查脫靶RNA結(jié)合非常重要。迪士尼也有針對(duì)這些問(wèn)題的入門工具箱。

一種選擇是化學(xué)交聯(lián)和通過(guò)下拉分離，或Chem-CLIP(Angew Chem Int Ed Engl，52：1001-13,2013)。研究人員將他們的RNA結(jié)合小分子與交聯(lián)劑(如烷基化劑苯丁酸氮芥)和一種方便的下拉劑(如生物素)聯(lián)系起來(lái)。交聯(lián)劑將小分子附著到RNA靶序列上。然后，科學(xué)家們可以通過(guò)測(cè)序確定拉下結(jié)合的RNA并進(jìn)行鑒定。

對(duì)于那些不喜歡Chem-CLIP要求的化學(xué)研究人員，迪士尼開發(fā)了一種不同的選擇，稱為反義寡核苷酸配體結(jié)合位點(diǎn)定位，或ASO-Bind-Map，以檢查小分子與特定RNA的相互作用(Chem， 4：2384-404,2018)。它依賴于所討論的小分子來(lái)粘附靶序列并阻斷ASO結(jié)合。如果ASO不能結(jié)合，它將不會(huì)促進(jìn)與其序列匹配的RNA的破壞。在ASO-Bind-Map中，研究人員用小分子和一系列ASO處理靶細(xì)胞的細(xì)胞。然后，他們可以擴(kuò)增和測(cè)序該靶RNA，尋找受ASO介導(dǎo)的破壞保護(hù)的區(qū)域。

即使有這些最新進(jìn)展，RNA藥物工具箱還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。迪士尼表示，制藥行業(yè)需要更多這樣的檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證目標(biāo)。而Weeks希望提高SHAPE推斷RNA的三級(jí)形狀的能力。如果科學(xué)家們使用它們來(lái)識(shí)別RNAs的正確位置(具有可能藥物的口袋)，那么像Weeks和迪士尼這樣的設(shè)計(jì)工具可以與屏幕一起工作，可以在屏幕上用作誘餌。

像脊柱肌肉萎縮藥物這樣的項(xiàng)目 - 現(xiàn)在正在臨床試驗(yàn)中 - 以及研究人員發(fā)現(xiàn)的其他先導(dǎo)化合物表明它是一個(gè)值得填充的工具箱。迪士尼說(shuō)：“所有這些東西都說(shuō)，是的，你可以用小分子吸毒。”“我們真的需要這樣做。”