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        新的CRISPR-Cas9變體可以響應病毒蛋白酶
        
			
        
				2019-02-19 15:22:19
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        加利福尼亞大學伯克利分校的研究人員利用一種稱為循環(huán)排列的技術，創(chuàng)造了一套名為Cas9-CP的新型Cas9變體，它將簡化Cas9融合蛋白的設計，適用于簡單DNA切割以外的各種應用，如堿基編輯和表觀遺傳修改。這項工作將于1月10日發(fā)表在Cell雜志上。
        

        新的CRISPR-Cas9變體可以響應病毒蛋白酶
        

        通過相同的過程，研究人員將“永遠在線”的Cas9分子轉變?yōu)榭杉せ畹拈_關，這些開關保持在“關閉”位置，直到被稱為蛋白酶的酶激活。由此產生的蛋白酶感應Cas9s(ProCas9s)可以減少脫靶效應并實現(xiàn)分子感應，以及組織或器官特異性基因組編輯。研究人員證明，ProCas9s可用于檢測病毒蛋白酶，可能作為一種能夠引發(fā)免疫反應的病原體感應系統(tǒng)。
        

        加州大學伯克利分校的生物化學家，資深作者大衛(wèi)薩維奇說：“我們并沒有堅持大自然給我們的基因組編輯蛋白質。” “這些蛋白質可以精心優(yōu)化，并變成具有適合人體細胞特性的支架。”
        

        CRISPR-Cas蛋白如Cas9是保護細菌免受入侵病毒的酶。這種細菌防御系統(tǒng)已被重新用于基因組編輯應用，例如在各種細胞類型和生物體中滅活基因。Cas9進化為細菌防御系統(tǒng)，并且它不一定具有哺乳動物細胞中基因組編輯所需的特性，例如基因組靶向的極高準確度和精確度，或控制酶的空間和時間活性的能力。
        

        雖然已構建Cas9融合蛋白以有效編輯DNA中的核苷酸，或通過表觀遺傳修飾激活或抑制轉錄 - 在不改變DNA序列的情況下影響基因活性的變化 - 每個新應用都需要深入的工程方法并進行費力的優(yōu)化。另一個主要障礙是Cas9始終處于“開啟”狀態(tài)。對蛋白質活性缺乏控制使得難以靶向特定細胞或組織，導致無意的基因組編輯和更大的脫靶基因組損傷，并且阻止使用Cas9作為細胞事件的分子記錄器。
        

        為了克服這些障礙，Savage和他的團隊使用循環(huán)排列來重新設計Cas9的分子序列，從而更好地控制其活性并為融合蛋白創(chuàng)建更優(yōu)化的DNA結合支架。該Cas9重新連接方法涉及將蛋白質的末端(即其N-和C-末端)與肽接頭連接，同時在不同位置分裂其序列以產生新的相鄰N-和C-末端。
        

        研究人員發(fā)現(xiàn)，Cas9對圓形排列具有很強的延展性。蛋白質的幾個區(qū)域具有可在多個位置打開的熱點，以產生多種Cas9-CP，其可用作高級融合蛋白的支架。目前，Cas9的N-和C-末端是固定的，并且它們不是理想地用于融合蛋白以獲得DNA。相比之下，新蛋白質支架的末端更靠近蛋白質的DNA相互作用界面，并且被優(yōu)化用于融合蛋白質的有效構建。
        

        研究人員接下來通過設計肽接頭產生ProCas9s，使接頭足夠短以將蛋白質限制為無活性狀態(tài)，然后引入可通過匹配病毒蛋白酶切割的序列。然后調整這些ProCas9用作利他防御系統(tǒng)，其可以檢測和響應病原體，產生大量DNA損傷并在通過切割接頭肽激活時殺死受感染的細胞。
        

        “我可以設想各種生物醫(yī)學應用，其中Cas9-CP和ProCas9s將使我們能夠更好地了解疾病過程，并使CRISPR-Cas基因組編輯和修飾的轉化應用更加安全，”加利福尼亞大學的共同第一作者Christof Fellmann說。 ，伯克利。
        

        在未來的研究中，研究人員將致力于開發(fā)Cas9融合蛋白用于堿基編輯和表觀遺傳修飾。此外，他們計劃測試ProCas9s是否可用于構建整個合成免疫系統(tǒng)。也可能開發(fā)對內源性蛋白酶敏感的ProCas9以靶向特定細胞，例如，編輯癌細胞的基因組。“我們的ProCas9系統(tǒng)在控制Cas9有用的任何情況下都很有用，”Savage說。
        
			

			
          
        
			
        
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