CRISPR系統(tǒng)一直是一個熱門的研究課題，因為它們在2012年被證明可以用作基因工程工具。它們通常以大多數(shù)人都能理解的方式解釋。但這些解釋往往忽略了關鍵細節(jié) - 比如科學家們仍在探索這些系統(tǒng)如何運作的基本規(guī)則。

例如，這里有一個簡化的解釋：CRISPR-Cas系統(tǒng)可以保護細菌免受病毒等入侵者的攻擊。他們通過創(chuàng)建與特定入侵者特有的DNA序列相匹配的小鏈RNA來實現(xiàn)這一目標。當那些CRISPR RNA找到匹配時，它們會釋放Cas蛋白，這些蛋白會切斷入侵者的DNA，阻止它復制。

但當然它比那更復雜。例如，有六種不同類型的CRISPR系統(tǒng)(我們知道)。最廣泛研究的CRISPR系統(tǒng)之一是CRISPR-Cas9，其是II型CRISPR系統(tǒng)。但自然界中最常見的CRISPR系統(tǒng)是I型。來自北卡羅來納州的新研究揭示了控制I型CRISPR系統(tǒng)的一些基本規(guī)則 - 例如CRISPR RNA可以存在多長時間，以及如何改變CRISPR RNA影響系統(tǒng)的行為。

為了了解更多信息，我們與Chase Beisel和Michelle Luo進行了交談，后者最近與蒙大拿州立大學的兩個小組合作，發(fā)表了一篇關于核酸研究工作的論文。Beisel是北卡羅來納州化學和生物分子工程的助理教授; 羅博士是博士。Beisel實驗室的學生。

摘要：為什么特別感興趣的I型CRISPR系統(tǒng)?

Michelle Luo：正如您所提到的，I型系統(tǒng)是最常見的CRISPR-Cas系統(tǒng)。它們占已知系統(tǒng)的一半以上。當我們考慮將有機體自身的系統(tǒng)用于其他目的時，這是特別令人感興趣的。雖然CRISPR-Cas9無疑是一種革命性的遺傳工具，但它依賴于將這種外源Cas9蛋白導入生物體。這是一項非常重要的任務。但是，如果您使用生物體自身的CRISPR-Cas蛋白，如我們之前的工作所示，您可以避免表達非天然蛋白質的挑戰(zhàn)。由于I型系統(tǒng)如此普遍，它們提供了一種有前景的途徑來探索如何利用天然CRISPR-Cas系統(tǒng)進行其他方法。

摘要：在您最近的工作中，您正在評估如何以及是否可以修改I型CRISPR系統(tǒng)中的RNA。具體來說，您正在研究是否可以修改I型CRISPR系統(tǒng)中的RNA長度。你為什么要改變RNA的長度?

羅：兩年前，發(fā)表了許多論文，詳細介紹了I型蛋白質復合物的晶體結構，這些蛋白質復合物結合并有助于降解靶DNA。這些出版物暗示CRISPR RNA作為支架來組裝復合物中的不同蛋白質。換句話說，RNA作為這些蛋白質的框架。因此，我們假設如果我們改變CRISPR RNA的長度，我們可以改變I型蛋白質復合物的大小和組成，并可能改變復合物的行為。

摘要：如何或為什么擴展DNA識別中使用的蛋白質復合物是有用的?

Chase Beisel：進入這個項目，我們不知道更長的RNA是否會讓復合物更均勻地組裝，更不用說正常運作了。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)，較長的RNA仍然形成一個穩(wěn)定的復合物，可以結合并指導DNA的切割。因為這種復合物更大并且識別更長的靶序列，我們最初設想該復合物可用于更特異性的DNA編輯或用于控制基因表達。

摘要：當我想到CRISPR時，我想到一個系統(tǒng)要么單獨留下DNA，要么削減它。當你說改變RNA的長度在基因抑制中更有效時，你是什么意思?

羅：你的總結很重要。通常，CRISPR-Cas系統(tǒng)調查DNA景觀，如果他們檢測到目標，他們將用微小的分子剪刀切割DNA。如果未確定目標，則DNA將保持不變。我們早期的工作表明，我們可以通過從等式中移除剪刀來防止切割DNA。我們通過從基因組I型基因座中刪除cas3基因來做到這一點。現(xiàn)在，CRISPR-Cas系統(tǒng)不是切割DNA，而是簡單地結合DNA。如果我們將這些修飾的系統(tǒng)導向基因，它將阻斷該基因的表達。我們最近的研究表明，改變RNA的長度會影響沉默發(fā)生的強度。對于某些區(qū)域，CRISPR RNA越長，抑制越強。

摘要：這是否使CRISPR系統(tǒng)更具體?即，它是否允許系統(tǒng)在其“攻擊”的DNA方面更具針對性?

Beisel：我們想知道同樣的事情。事實上，我們確實探索了RNA的長度如何影響特異性作為出版物的一部分，盡管結果參差不齊。一方面，更多的RNA參與堿基配對，其中更多的堿基配對必然意味著更高的特異性。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)較長的RNA適應與靶序列的錯配，表明特異性較弱。最后，需要更多的實驗來探索特異性問題以及它如何影響I型系統(tǒng)的任何下游用途。

摘要：如何使用基因抑制功能?有沒有潛在的應用?

羅：當然!這對于代謝工程尤其有希望。如果你想讓微生物工廠生產(chǎn)一種有價值的有價值的產(chǎn)品，比如生物燃料，你就必須改變有機體的新陳代謝。這需要過量表達導致生產(chǎn)的基因并關閉與生產(chǎn)競爭的基因。我們的系統(tǒng)允許研究人員以有效，特定位點，可逆和多重的方式關閉基因。我們的最新發(fā)現(xiàn)表明，您可以通過改變CRISPR RNA的長度來微調基于CRISPR的基因抑制的程度。這就是我們最近在核酸研究中發(fā)表的論文。

摘要：這項研究的未來方向是什么?

Beisel：除了Michelle提到的應用之外，我們感興趣的是為什么大自然只使用固定長度的RNA，因為較長的RNA可以產(chǎn)生完美的功能性復合物。我們也對這種現(xiàn)象是否適用于許多不同類型的I型系統(tǒng)感興趣，從那些使用復雜的蛋白質遠遠少于生活在極端溫度的生物體中的蛋白質。

Beisel：我們想知道同樣的事情。事實上，我們確實探索了RNA的長度如何影響特異性作為出版物的一部分，盡管結果參差不齊。一方面，更多的RNA參與堿基配對，其中更多的堿基配對必然意味著更高的特異性。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)較長的RNA適應與靶序列的錯配，表明特異性較弱。最后，需要更多的實驗來探索特異性問題以及它如何影響I型系統(tǒng)的任何下游用途。

摘要：如何使用基因抑制功能?有沒有潛在的應用?

羅：當然!這對于代謝工程尤其有希望。如果你想讓微生物工廠生產(chǎn)一種有價值的有價值的產(chǎn)品，比如生物燃料，你就必須改變有機體的新陳代謝。這需要過量表達導致生產(chǎn)的基因并關閉與生產(chǎn)競爭的基因。我們的系統(tǒng)允許研究人員以有效，特定位點，可逆和多重的方式關閉基因。我們的最新發(fā)現(xiàn)表明，您可以通過改變CRISPR RNA的長度來微調基于CRISPR的基因抑制的程度。這就是我們最近在核酸研究中發(fā)表的論文。

摘要：這項研究的未來方向是什么?

Beisel：除了Michelle提到的應用之外，我們感興趣的是為什么大自然只使用固定長度的RNA，因為較長的RNA可以產(chǎn)生完美的功能性復合物。我們也對這種現(xiàn)象是否適用于許多不同類型的I型系統(tǒng)感興趣，從那些使用復雜的蛋白質遠遠少于生活在極端溫度的生物體中的蛋白質。