萊斯大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種計(jì)算模型來量化CRISPR-Cas9蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)其基因組編輯目標(biāo)的機(jī)制。化學(xué)和化學(xué)與生物分子工程的萊斯教授阿納托利科洛梅斯基和校友阿列克謝希弗特改編了他們之前開發(fā)的系統(tǒng)，以展示蛋白質(zhì)如何找到它們的生物靶標(biāo)。他們希望修改后的模型能夠幫助解開CRISPR的其余奧秘。

在其天然狀態(tài)下，CRISPR代表“聚集有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列”，是細(xì)菌保護(hù)自身免受病毒感染的生物學(xué)機(jī)制。這些細(xì)菌包含了一份外國(guó)DNA，并建立了所有入侵者的記錄。它們?cè)跈z測(cè)到新入侵者時(shí)引用該記錄并使用它來銷毀它們。

近年來，研究人員已開始調(diào)整基因組編輯中使用的機(jī)制，該機(jī)制有可能治愈疾病并增強(qiáng)包括人類在內(nèi)的生物體。但一個(gè)絆腳石的風(fēng)險(xiǎn)是CRISPR-Cas9蛋白(利用CRISPR方法的系統(tǒng)之一)將切割并替換錯(cuò)誤的靶序列，引入突變。

生物物理雜志中描述的Rice模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)允許這些脫靶編輯發(fā)生時(shí)，CRISPR-Cas9可能更有效地定位良好的靶標(biāo)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)不會(huì)浪費(fèi)時(shí)間與脫靶相關(guān)以繼續(xù)搜索。

Kolomeisky說，這可能是也可能不是一件好事，但它肯定值得研究。“錯(cuò)誤率(脫靶率)有時(shí)是10-20%，”他說。“我們有兩個(gè)想法：一個(gè)是病毒變異非?？?，也許細(xì)菌試圖削減只是稍微突變的目標(biāo)，以便更靈活。另一個(gè)是有蛋白質(zhì)可以糾正錯(cuò)誤，所以如果錯(cuò)誤的削減并不多，系統(tǒng)可以容忍它們。

Kolomeisky說，他的模型是一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟，可以找出CRISPR編輯的動(dòng)態(tài)。“CRISPR-Cas9是最受歡迎的變種，因?yàn)樗缓幸环N蛋白質(zhì)，在生物學(xué)上更容易使用，”他說。

萊斯實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了其原始模型，以了解蛋白質(zhì)如何沿著DNA滑動(dòng)以找到目標(biāo)并觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄等過程。Kolomeisky指出，CRISPR先驅(qū)Jennifer Doudna發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9不會(huì)以同樣的方式尋找。“她發(fā)現(xiàn)它不會(huì)在DNA的任何地方滑動(dòng)，”他說。

相反，根據(jù)Doudna和她的團(tuán)隊(duì)，蛋白質(zhì)最初識(shí)別三核苷酸PAM(用于原型間隔相鄰基序)序列，標(biāo)記潛在靶標(biāo)的位置。“CRISPR發(fā)現(xiàn)并結(jié)合PAM，然后其相關(guān)的RNA探索相鄰的DNA，看看它是否是目標(biāo)，”Kolomeisky說。“如果是的話，蛋白質(zhì)會(huì)開始減少。如果沒有，它會(huì)解除分離，并在其他地方尋找。”

在Doudna隨后刪除PAM序列的實(shí)驗(yàn)中，CRISPR-Cas9蛋白根本找不到它們的靶標(biāo)。因此，PAMs具有重要作用，而不僅僅是一個(gè)通用的間隔物，他說。“一旦我讀到這篇文章，我就知道我們也可以在這里使用我們的模型。”

理論模型著眼于第一次通過過程 - 當(dāng)系統(tǒng)超過物理或化學(xué)閾值時(shí)發(fā)生的那些過程，例如找到相關(guān)的PAM來跟蹤插入到細(xì)胞中的CRISPR-Cas9蛋白，因?yàn)樗鼈兪紫日{(diào)查PAM序列，然后結(jié)合到PAMs，搜索與Cas9 RNA相匹配的DNA靶標(biāo)。

他們發(fā)現(xiàn)，通過與“錯(cuò)誤的”DNA分離而避免脫靶的切割的CRISPR比需要更長(zhǎng)時(shí)間定位的CRISPR比僅僅切斷目標(biāo)的更長(zhǎng)。“走向錯(cuò)誤的PAM需要時(shí)間，”Kolomeisky說。“我們的計(jì)算結(jié)果表明，當(dāng)有時(shí)候切入錯(cuò)誤的地方時(shí)，CRISPR可以更快找到真正的目標(biāo)。進(jìn)入正確目標(biāo)的部分可能會(huì)更小，但最終會(huì)削減它們。

“這是一個(gè)簡(jiǎn)單的模型，完全可以解決，”Kolomeisky說。“如果有人想測(cè)試，該模型可以提供具體的預(yù)測(cè)，并在某些情況下提供應(yīng)該觀察的趨勢(shì)。” 模型中遺漏的是能夠看到RNA密鑰是否同時(shí)識(shí)別其靶標(biāo)同時(shí)與DNA結(jié)合 - 或者依次與核苷酸核苷酸結(jié)合。

“關(guān)于CRISPR的最令人印象深刻的事情不是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)，而是在生物技術(shù)方面創(chuàng)造了一場(chǎng)革命，因?yàn)檫@意味著在任何細(xì)胞中我們都可以在特定位置切割任何DNA，非常精確，”科洛梅斯基說。“我希望我們的工作能夠激發(fā)更多的基礎(chǔ)研究，因?yàn)槲曳浅Ｏ矚gCRISPR方法。但是當(dāng)人們應(yīng)用它而不理解它在分子水平上如何工作時(shí)，我感到不快樂。”

Shvets現(xiàn)在是麻省理工學(xué)院的博士后研究員。Kolomeisky是化學(xué)和化學(xué)與生物分子工程的教授。