來自不同領域的PIPPI科學家正在開發(fā)方法，工具和數(shù)據庫，以指導合理配制強大的蛋白質療法。他們的總體目標是開發(fā)一個數(shù)據庫來指導產品配方的開發(fā)。動態(tài)光散射(DLS)是用于高通量聚集篩選的主要生物物理技術，PIPPI廣泛使用。

在接受News-Medical和Life Sciences的采訪時，Lorenzo Gentiluomo詳述了用于評估穩(wěn)定性的各種DLS方法，包括一些新穎的應用。他還解釋了DLS等高吞吐量技術的發(fā)展如何極大地增加了查找數(shù)據模式的機會以及機器學習在此過程中的作用。

你能解釋光散射在PIPPI研究中的作用嗎?

PIPPI聯(lián)盟正在編制一個包含18種代表性蛋白質的數(shù)據庫，以表征成功配方開發(fā)的關鍵屬性。它將包括24種配方的基本特征，作為鹽濃度和pH的函數(shù)。此外，一些配方將進行更深入的分子表征，其中蛋白質的結構特性與溶液行為有關。

這項工作的一個重要部分是使用動態(tài)光散射(DLS)和靜態(tài)光散射(SLS)研究蛋白質 - 蛋白質相互作用。我們使用Wyatt的DynaPro Plate Reader測量蛋白質相互作用，該讀數(shù)器具有溫度控制的微孔板。

DynaPro Plate Reader可以對蛋白質的大小，分子量和相互作用進行DLS和SLS測量，從而很好地理解蛋白質制劑的物理穩(wěn)定性?？梢源_定尺寸，分子量，多分散性，粘度和相互作用參數(shù)，然后確定配方條件和溫度。

我們通過遵循平移擴散系數(shù)kD的濃度依賴性，使用DLS測量蛋白質 - 蛋白質相互作用。通過同時測量SLS，我們還可以確定成對分子間相互作用的強度，即第二維里系數(shù)A2或B22。這提供了一種對膠體穩(wěn)定性配方進行分級的好方法。

有兩種理論用于描述成對蛋白質 - 蛋白質分子間相互作用。我更喜歡使用接近能量框架，即反映距離依賴性的勢能差異。增加離子強度可以屏蔽電荷 - 電荷相互作用，并且應該提供更快的聚集，因為分子更容易相互作用。

擴散相互作用參數(shù)kD已經表明它是配方的關鍵生物物理特性;它不僅是蛋白質相互作用的衡量標準。最近對抗體制劑的kD測量揭示了kD與制劑的表觀溶解度，熱穩(wěn)定性，流變學和靜電性質之間的關系。

您對蛋白質的哪些特性有所描述?

我們將18種蛋白質的24種制劑表征為pH和離子強度的函數(shù)，然后應用計算屏幕，計算具有相對分子描述符的24種不同制劑中的每一種中蛋白質的3D結構。從篩選中，我們收集了一系列產出。一些來自通過DLS進行的應力測定以及通過與多角度光散射(SEC-MALS)結合的尺寸排阻色譜法。

一個重要的參數(shù)是暴露于熱應力時的聚集模式，因為這可以使我們更好地理解配方開發(fā)過程中解決問題的需要。為了評估蛋白質的熱穩(wěn)定性，測量聚集作為pH和離子強度的函數(shù)。使用相同濃度的緩沖液，但加入不同量的鹽以改變離子強度。通過SLS測量聚集發(fā)生的溫度(Tagg)。應該注意的是，Tagg并不總是與結構穩(wěn)定性相關，因為聚集可以在蛋白質開始展開之前發(fā)生(由內在熒光確定)。

聚合模式可以告訴您蛋白質的行為方式。例如，如果聚集在兩個步驟中發(fā)生，其間存在平臺，這表明蛋白質最可能在單體和復合物之間具有平衡 - 它不僅與溫度有關。

我們還使用光散射來評估蛋白質 - 蛋白質相互作用以及它如何隨著不同的離子強度而變化。kD曲線的形狀通常是pH的函數(shù)，并且通過添加鹽而變平。當我看到這樣的扁平化時，我知道聚集是由疏水或偶極相互作用引起的。

在某些情況下，尺寸排阻色譜的結果和來自原始樣品的DLS的結果不一致。重要的是要將兩種測量結果都考慮在內，以便對配方有一個很好的理解。

您如何使用此類信息評估配方?

一旦我們測量了各種輸出，我們就可以使用同源建模將它們與結構信息進行比較。通過這種方式，我們可以找出表面變化的原因。如果我們發(fā)現(xiàn)kD對于不同的抗體以某種方式趨勢，我們可以評估這是否是由于疏水補丁引起的。

然而，我們的最終目標是使用分子描述符來嘗試生成可用于預測特定蛋白質結果的全局算法。我們的系統(tǒng)方法應該有助于指出哪些是蛋白質配方的關鍵生物物理特性和數(shù)據挖掘技術的應用。我們確實相信，我們的數(shù)據庫可以快速，節(jié)省成本地評估發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在篩選期間，使用DynaPro平板讀數(shù)器和SEC-MALS收集總數(shù)據點的75%，其中后者包括或連接到Wyatt miniDAWN MALS儀器和Wyatt Optilab差示折射計的HPLC裝置。因此，您可以看到光散射對蛋白質配方開發(fā)的貢獻非常顯著。

您用于研究蛋白質穩(wěn)定性的新方法是什么?

首先，將抗體在變性劑鹽酸胍中孵育，這允許我們使用等溫化學變性技術(ICD)通過內在蛋白質熒光跟蹤結構的擾動。然后，我們應用了一種新方法，即'變性劑稀釋液(DFD)我們使用DynaPro Plate Reader以新穎的方式研究單克隆抗體的物理穩(wěn)定性。

通過隨后用緩沖液稀釋變性溶液，我們可以評估物理穩(wěn)定性的水平。如果物理穩(wěn)定性較低，最終解決方案將具有比較高的聚集體或更多聚集體。當我們將DLS測量與SEC-MALS分析進行比較時，我們發(fā)現(xiàn)較高的流體動力學半徑與更多的聚集體正相關。由于動態(tài)光散射對聚集檢測非常敏感，并且(與SEC-MALS不同)是一種高通量技術，因此它為這種研究中的評估提供了理想的方法。

使用兩種不同的緩沖液 - 組氨酸和檸檬酸鹽 - 但相同的pH，由ICD評估的構象穩(wěn)定性非常相似。然而，使用DFD我們能夠通過DLS和流體動力學半徑區(qū)分最終穩(wěn)定性，這與膠體穩(wěn)定性有關。這個值就是我們只需要一個值，即流體動力學半徑，就可以得到全貌。

從我們的觀點來看，在從不同濃度的變性劑稀釋后使用DynaPro Plate Reader跟蹤聚集是一種非常有前途的方法，用于探測蛋白質在不同配方中的物理穩(wěn)定性。

DFD方法是等溫的，因此我們避免了樣品加熱引起的所有問題，例如，可能發(fā)生的緩沖液pH的變化。它只需要非常短的測量時間，因此具有很小的縮小和自動化潛力。而且，它可以區(qū)分重疊的ICD曲線。這意味著您可以通過量化其膠體穩(wěn)定性而無需額外努力來區(qū)分具有相同構象穩(wěn)定性的兩種制劑。

機器學習算法如何適應?

機器學習算法是人工神經網絡在蛋白質制劑開發(fā)中的應用。人工神經網絡具有處理藥物開發(fā)過程中經常遇到的高度神經線性問題的能力。

我們開發(fā)了一種人工神經網絡算法，以提高我們對蛋白質溶液行為的理解。我們將數(shù)據提供給算法，并預測結果。例如，如果我們輸入有關主要序列和配方的信息，我們將恢復聚合的溫度。

因此，人工神經網絡代表了經典統(tǒng)計方法的一個非常有趣的替代方案。當應用于高度非線性的數(shù)據集時，它可以相當成功，并且這種數(shù)據集是制藥開發(fā)中最常遇到的。

它可以應用于簡單地基于氨基酸組成優(yōu)化生物制劑。這將允許選擇具有良好預測的Tm，Tagg，kD的蛋白質結構，并且在某些情況下單體保留，甚至在它們在細胞中表達之前。

使用各種模型，我們驗證了算法，發(fā)現(xiàn)Tagg的預測非常準確。它還準確地預測kD是陽性還是陰性(即，蛋白質是自排斥的或自我吸引的，分別對應于膠體穩(wěn)定性或不穩(wěn)定性)。回歸問題很難解決，所以我們關注的是kD的符號而不是推導出一個定量值。

我們還對預測應力后的單體保留或損失感興趣。單體保留的預測，即在應力下不聚集或碎裂的材料的比例，也是相當準確的。

大量的背景噪音意味著很難區(qū)分不同的配方。但是，我們可以預測一種蛋白質是否比另一種蛋白質更穩(wěn)定。由于這是從初級序列預測的，因此我們可以對候選生物制劑的穩(wěn)定性進行相對可靠的估計，而無需對每種蛋白質進行表達和直接測量。

神經網絡的主要缺點是可解釋性。神經網絡的輸出不是描述實際的算法過程，而是對輸入算法的數(shù)據的解釋。它確實有助于我們繪制相關性，這可以為我們提供有關該過程的更多信息。

總之，高通量光散射是篩選和深入表征蛋白質物理穩(wěn)定性的完美工具。一旦完成，PIPPI數(shù)據庫將有助于快速評估蛋白質是否適合開發(fā)。同樣，機器學習算法將提供數(shù)據驅動的預測，以通知這些決策，并在新蛋白療法的開發(fā)過程中實現(xiàn)成本節(jié)約。