在一項(xiàng)對研究，醫(yī)學(xué)和工業(yè)產(chǎn)生重大影響的成就中，加州大學(xué)舊金山分校的科學(xué)家們已經(jīng)對人體免疫細(xì)胞進(jìn)行了遺傳重編程，稱為T細(xì)胞而不使用病毒插入DNA。研究人員表示，他們希望他們的技術(shù) - 采用CRISPR基因編輯技術(shù)的快速，通用和經(jīng)濟(jì)的方法 - 在新興的細(xì)胞治療領(lǐng)域被廣泛采用，從而加速開發(fā)新的和更安全的癌癥，自身免疫和其他治療方法。疾病，包括罕見的遺傳性疾病。

這種新方法描述于2018年7月11日出版的Nature，它提供了一種強(qiáng)大的分子“切割和粘貼”系統(tǒng)，用于重寫人類T細(xì)胞中的基因組序列。它依賴于電穿孔，這是一種將電場施加到細(xì)胞上以使其膜暫時(shí)更具滲透性的過程。在一年內(nèi)試驗(yàn)了數(shù)千個(gè)變量后，加州大學(xué)舊金山分校的研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某些數(shù)量的T細(xì)胞，DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起，然后暴露在適當(dāng)?shù)碾妶鲋袝r(shí)，T細(xì)胞就會在這些元件中，精確地將特定的基因序列整合到基因組中編程的CRISPR編程位點(diǎn)。

“這是一種快速，靈活的方法，可用于改變，增強(qiáng)和重新編程T細(xì)胞，因此我們可以為他們提供我們想要摧毀癌癥，識別感染或遏制自身免疫性疾病中過度免疫反應(yīng)的特異性，”加州大學(xué)舊金山分校的Alex Marson，醫(yī)學(xué)博士，博士，微生物學(xué)和免疫學(xué)副教授，加州大學(xué)舊金山分校海倫迪勒家庭綜合癌癥中心成員，以及新研究的高級作者。“現(xiàn)在我們在所有這些方面都參加了比賽。”

但同樣重要的是新技術(shù)的速度和易用性，Marson，也是創(chuàng)新基因組學(xué)研究所的生物醫(yī)學(xué)科學(xué)主任說，這種方法可以將大量的DNA插入T細(xì)胞，這可以賦予T細(xì)胞細(xì)胞具有強(qiáng)大的新特性。Marson實(shí)驗(yàn)室的成員使用電穿孔和CRISPR將一些遺傳物質(zhì)插入到T細(xì)胞中取得了一些成功，但直到現(xiàn)在，許多研究人員多次嘗試將長序列DNA置于T細(xì)胞中導(dǎo)致細(xì)胞死亡，導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞死亡。相信大的DNA序列對T細(xì)胞過度毒性。

為了證明新方法的多功能性和功效，研究人員用它來修復(fù)患有罕見遺傳形式的自身免疫的兒童T細(xì)胞中的致病基因突變，并且還創(chuàng)建了定制的T細(xì)胞來尋找和殺死人類黑色素瘤細(xì)胞。

病毒通過細(xì)胞膜注射自己的遺傳物質(zhì)引起感染，自20世紀(jì)70年代以來，科學(xué)家利用這種能力，剝奪感染性病毒的病毒，并利用生成的“病毒載體”將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中進(jìn)行研究，基因治療，并在最近公布的例子，用于創(chuàng)建用于癌癥免疫療法的CAR-T細(xì)胞。

用病毒工程改造的T細(xì)胞現(xiàn)在被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于對抗某些類型的白血病和淋巴瘤。但是，創(chuàng)建病毒載體是一項(xiàng)艱苦而昂貴的過程，臨床級載體的短缺導(dǎo)致基因療法和基于細(xì)胞的療法的制造瓶頸。即使可用，病毒載體仍遠(yuǎn)非理想，因?yàn)樗鼈儗⒒螂S意插入細(xì)胞基因組中，這可能損害現(xiàn)有的健康基因或留下由監(jiān)管機(jī)制無法控制的新引入的基因，從而確保細(xì)胞正常運(yùn)作。這些可能導(dǎo)致嚴(yán)重副作用的限制引起基因治療和細(xì)胞療法如基于CAR-T的免疫療法的關(guān)注。

“試圖將新基因?qū)隩細(xì)胞已有30年的努力，”第一作者Theo Roth說，他是一名攻讀醫(yī)學(xué)博士和博士學(xué)位的學(xué)生。加州大學(xué)舊金山分校醫(yī)學(xué)科學(xué)家培訓(xùn)計(jì)劃的學(xué)位，他在Marson實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并領(lǐng)導(dǎo)了這項(xiàng)新研究。“現(xiàn)在不再需要六個(gè)或七個(gè)人在實(shí)驗(yàn)室中使用病毒來設(shè)計(jì)T細(xì)胞，如果我們開始看到數(shù)百個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)這些細(xì)胞而不僅僅是少數(shù)，并且越來越多地工作復(fù)雜的DNA序列，我們將嘗試更多的可能性，它將顯著加快未來幾代細(xì)胞療法的發(fā)展。“

經(jīng)過近一年的反復(fù)試驗(yàn)，Roth確定了T細(xì)胞群體，DNA數(shù)量和CRISPR豐度的比例，結(jié)合使用適當(dāng)參數(shù)傳遞的電場，可以有效，準(zhǔn)確地編輯T細(xì)胞。 '基因組。

為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，羅斯指示CRISPR用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記一系列不同的T細(xì)胞蛋白，結(jié)果具有高度特異性，具有非常低水平的“脫靶”效應(yīng)：每個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)Roth的CRISPR模板設(shè)計(jì)用GFP標(biāo)記，沒有其他人在顯微鏡下發(fā)出綠光。

然后，在設(shè)計(jì)用作新技術(shù)治療前景原理的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，Roth，Marson及其同事展示了它如何潛在地用于整合T細(xì)胞對抗自身免疫性疾病或癌癥。

在第一個(gè)例子中，Roth及其同事使用由耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的醫(yī)學(xué)博士Kevan Herold提供給Marson實(shí)驗(yàn)室的T細(xì)胞。這些細(xì)胞來自三個(gè)兄弟姐妹，患有罕見的嚴(yán)重自身免疫性疾病，迄今為止一直對治療有抵抗力。基因組測序顯示，這些兒童的T細(xì)胞攜帶一種名為IL2RA的基因突變。該基因包含對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或Tregs發(fā)育所必需的細(xì)胞表面受體的說明，其可以控制其他免疫細(xì)胞并防止自身免疫。

利用非病毒CRISPR技術(shù)，UCSF團(tuán)隊(duì)能夠快速修復(fù)兒童T細(xì)胞中的IL2RA缺陷，并恢復(fù)受突變影響的細(xì)胞信號。在CAR-T治療中，已經(jīng)從體內(nèi)移除的T細(xì)胞被設(shè)計(jì)為增強(qiáng)其抗癌能力，然后返回身體以靶向腫瘤。研究人員希望類似的方法可以有效治療Tregs發(fā)生故障的自身免疫性疾病，例如在三名患有IL2RA突變的兒童中看到的疾病。

在與加州大學(xué)洛杉磯分校Parker癌癥免疫治療研究所的Cristina Puig-Saus和醫(yī)學(xué)博士Antoni Ribas合作進(jìn)行的第二組實(shí)驗(yàn)中，科學(xué)家完全取代了正常人群中的天然T細(xì)胞受體。具有新受體的T細(xì)胞經(jīng)過專門設(shè)計(jì)以尋找人黑素瘤細(xì)胞的特定亞型。T細(xì)胞受體是細(xì)胞用于檢測疾病或感染的傳感器，并且在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿中，工程細(xì)胞有效地歸巢于靶向黑素瘤細(xì)胞而忽略其他細(xì)胞，表現(xiàn)出精確癌癥醫(yī)學(xué)的主要目標(biāo)的那種特異性。

在不使用病毒的情況下，研究人員能夠生成大量經(jīng)過重新編程的CRISPR工程細(xì)胞，以展示新的T細(xì)胞受體。當(dāng)轉(zhuǎn)移到植入人黑素瘤腫瘤的小鼠中時(shí)，工程化的人T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤部位并顯示出抗癌活性。

“這種替代T細(xì)胞受體的策略可以推廣到任何T細(xì)胞受體，”Marson說，他也是加州大學(xué)舊金山分校帕克癌癥免疫治療研究所和Chan Zuckerberg Biohub研究員的成員。“通過這種新技術(shù)，我們可以剪切并粘貼到指定的位置，重寫基因組序列中的特定頁面。”

Roth說，因?yàn)樾录夹g(shù)可以在一周多一點(diǎn)的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)建可行的定制T細(xì)胞系，它已經(jīng)改變了Marson實(shí)驗(yàn)室的研究環(huán)境。由于病毒載體帶來的障礙，之前被認(rèn)為過于困難或昂貴的實(shí)驗(yàn)的想法現(xiàn)在已經(jīng)成熟，可供調(diào)查。“我們將研究20個(gè)'瘋狂'的想法，”Roth說，“因?yàn)槲覀兛梢苑浅？焖俚貏?chuàng)建CRISPR模板，一旦我們有了模板，我們就可以將它放入T細(xì)胞并快速生長。”

Marson將新方法的成功歸功于羅斯的“絕對堅(jiān)持”，面對人們普遍認(rèn)為病毒載體是必需的，并且T細(xì)胞只能容忍小片DNA。“Theo確信，如果我們能夠找到合適的條件，我們就可以克服這些感知的局限性，并且他付出了巨大努力來測試數(shù)以千計(jì)的不同條件：CRISPR與DNA的比例;培養(yǎng)細(xì)胞的不同方式;不同的電流。通過優(yōu)化每個(gè)參數(shù)并將最佳條件放在一起，他能夠看到這個(gè)驚人的結(jié)果。“