杜克大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)工程師使用CRISPR / Cas9基因工程技術(shù)關(guān)閉一種調(diào)節(jié)成年小鼠膽固醇水平的基因，導(dǎo)致單次治療后血液膽固醇水平降低和基因抑制持續(xù)6個月。

這標(biāo)志著研究人員首次將CRISPR / Cas9阻遏物用于成年動物模型中的靶向治療基因沉默。該研究于4月26日在Nature Communications網(wǎng)站上發(fā)布。

CRISPR / Cas9系統(tǒng)基于細(xì)菌中的抗病毒防御機(jī)制，其中Cas9酶識別先前感染的病毒DNA序列并在再感染期間切斷入侵的DNA。研究人員已經(jīng)設(shè)計(jì)了CRISPR / Cas9系統(tǒng)，不僅可以定位和切割特定的DNA序列，還可以打開或關(guān)閉靶基因的表達(dá)，而無需對DNA編碼序列進(jìn)行永久性更改。

盡管這種CRISPR / Cas9阻遏蛋白技術(shù)已經(jīng)成為破壞細(xì)胞培養(yǎng)模型中基因調(diào)控的有力工具，但它尚未適應(yīng)基因治療等應(yīng)用向成年動物的傳遞。

在他們最近的研究中，杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程的魯尼家庭副教授查爾斯·格斯巴赫(Charles Gersbach)和他的實(shí)驗(yàn)室成員開發(fā)了一種方法，可以有效地將CRISPR / Cas9阻遏物系統(tǒng)包裝并交付給小鼠。他們通過沉默Pcsk9來測試他們的傳遞系統(tǒng)，Pcsk9是一種調(diào)節(jié)膽固醇水平的基因。雖然已開發(fā)出幾種藥物通過阻斷Pcsk9的活性來治療高膽固醇和心血管疾病，但這種新方法將阻止Pcsk9的制造。

“我們之前使用這些相同類型的工具在培養(yǎng)的細(xì)胞中打開和關(guān)閉基因，我們希望看看我們是否也可以通過與基因治療相關(guān)的方法將它們傳遞給動物模型，”Gersbach說。“我們希望以一種具有治療效果的方式改變基因，而Pcsk9是一種有用的概念證據(jù)，因?yàn)樗梢哉{(diào)節(jié)膽固醇水平，從而影響心臟病等健康問題。”

為了測試成年動物中的靶向Pcsk9阻遏物，研究小組選擇使用腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體 - 在人類基因治療臨床試驗(yàn)中經(jīng)過工程改造以靶向多種組織類型的小病毒。由于載體的載貨量極小，該團(tuán)隊(duì)無法使用化膿性鏈球菌的常見Cas9酶。相反，他們選擇使用來自金黃色葡萄球菌的較小的Cas9。它們還使Cas9的DNA切割功能失活，產(chǎn)生了“死”形式的酶dCas9，其結(jié)合但不切割靶DNA序列。

dCas9可與KRAB蛋白結(jié)合，沉默基因表達(dá)，創(chuàng)建CRISPR / Cas9阻遏物，阻斷轉(zhuǎn)錄，降低染色質(zhì)可及性，沉默基因表達(dá)而不改變基礎(chǔ)DNA序列。研究人員利用腺病毒載體將基于CRISPR / Cas9的阻遏物傳遞給小鼠肝臟，降低了治療小鼠的Pcsk9和膽固醇水平。

雖然實(shí)驗(yàn)成功，但研究人員還觀察到僅在包括Cas9的治療中將肝酶釋放到血液中。雖然這些肝酶水平保持低于臨界閾值并隨時間標(biāo)準(zhǔn)化，但它們的升高水平表明該療法可能在肝臟中引起免疫應(yīng)答，其中病毒和Cas9酶累積。這引發(fā)了對多次注射療效的質(zhì)疑。

“我們發(fā)現(xiàn)的一個有趣的事情看起來就像對Cas9蛋白的免疫反應(yīng)，”在Gersbach實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)導(dǎo)這項(xiàng)工作的博士生Pratiksha Thakore說。“注射后，我們看到我們的靶基因Pcsk9的水平降低了，但我們也觀察到許多免疫細(xì)胞基因表達(dá)的增加，這表明我們將Cas9傳遞給小鼠后免疫細(xì)胞滲入肝臟。更好地了解這種免疫反應(yīng)以及如何調(diào)節(jié)它對于使用Cas9技術(shù)進(jìn)行治療非常重要。“

隨著研究人員開發(fā)出使用CRISPR / Cas9進(jìn)行治療和研究的新方法，有關(guān)生物體免疫系統(tǒng)如何響應(yīng)CRISPR / Cas9系統(tǒng)傳遞的更多信息正在出現(xiàn)。因?yàn)镃as9酶來自細(xì)菌，免疫系統(tǒng)可能將其識別為來自入侵生物體的外來蛋白質(zhì)并產(chǎn)生反應(yīng)。還有人擔(dān)心基于CRISPR / Cas9的療法的潛在患者可能已經(jīng)準(zhǔn)備好對這些系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因?yàn)檠芯恐凶畛Ｓ玫腃as9酶來自人類常規(guī)暴露的常見細(xì)菌。

“該領(lǐng)域剛剛開始關(guān)注這一點(diǎn)，很明顯免疫反應(yīng)是一個重要問題，”格斯巴赫說。“雖然我們在給予Cas9時確實(shí)看到了小鼠的免疫反應(yīng)，但是血清中的肝酶水平似乎在沒有任何干預(yù)的情況下隨著時間的推移而減輕，并且Pcsk9抑制的效果無論如何都是持續(xù)的。”

隨著他們繼續(xù)研究，Gersbach及其合作者希望收集更多信息，以更好地了解針對Cas9的免疫應(yīng)答和表觀遺傳調(diào)節(jié)的穩(wěn)定性。

“我們?nèi)匀挥泻芏鄸|西需要我們用這種方法來探索，”塔卡爾說。“CRISPR / Cas9工具在細(xì)胞培養(yǎng)模型中運(yùn)作良好，在體內(nèi)應(yīng)用它們更令人興奮，特別是當(dāng)我們檢查重要的治療靶點(diǎn)并使用與治療人類疾病相關(guān)的運(yùn)載工具時。”