盡管對CRISPR-Cas9基因編輯抱有很高的期望和高投入，但科學(xué)家仍然需要了解它如何在人體中發(fā)揮作用。在最新的例子中，加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，人們對Cas9酶切DNA后細胞如何修復(fù)基因組的假設(shè)是錯誤的。

這一發(fā)現(xiàn)深入探討了為什么CRISPR-Cas9基因編輯在幾乎所有細胞中都能很好地發(fā)揮作用，盡管在所有細胞中都沒有取得同樣的成功。并且它可以幫助研究人員提高細胞將新DNA插入基因組的效率 - 例如用正確的DNA序列替換有害突變 - 并且通常調(diào)整CRISPR-Cas9編輯以獲得期望的結(jié)果。

“如果你想治療鐮狀細胞性貧血，那么你成功的機會與用正確的鐮狀細胞基因取代突變的鐮狀細胞基因的效率密不可分，”加州大學(xué)伯克利分校博士后研究員Chris Richardson說道，他是一篇論文的第一作者。調(diào)查結(jié)果。“如果你從患者身上收獲了一百萬個細胞，并且你的插入率為10%，那就不如你有30%到40%那么好。能夠操縱這些細胞以增加這個過程的頻率，稱為同源導(dǎo)向修理，令人興奮。“

“基因編輯非常強大，有很多希望，但到目前為止，有很多試驗和錯誤。它在人體細胞中的工作方式一直是一個有很多假設(shè)的黑盒子，”主要作者Jacob Corn說。 ，加州大學(xué)伯克利分校和分子與細胞生物學(xué)的兼職教授。“我們終于開始了解正在發(fā)生的事情。”

Corn，Richardson和他們的同事將在8月出版的Nature Genetics期刊上發(fā)表他們的研究結(jié)果，現(xiàn)在可以在網(wǎng)上找到。

直到最近，Corn還是創(chuàng)新基因組學(xué)研究所的生物醫(yī)學(xué)科學(xué)主任，該研究所是加州大學(xué)伯克利分校和加州大學(xué)舊金山分校之間的聯(lián)合CRISPR研究項目。今年秋天，他將加入瑞士蘇黎世的ETH學(xué)院。

CRISPR依賴于DNA修復(fù)

CRISPR-Cas9具有革命性，因為它可以精確地利用基因組中數(shù)十億的特定DNA序列進行切割，并切割雙鏈DNA分子。但在那之后，由細胞來修復(fù)損傷。

修復(fù)可以通過兩種方式進行。酶可以將懸垂末端縫合在一起，這通常導(dǎo)致一個或多個堿基 - DNA的構(gòu)建塊被添加或刪除，破壞基因的功能?；蛘撸渌缚梢杂门cDNA切割上游和下游的DNA序列匹配的單鏈DNA修補斷裂。創(chuàng)建互補DNA鏈以完成雙鏈修復(fù)。

前者稱為非同源末端連接，似乎是CRISPR切割后最常見的結(jié)果。后者，同源定向修復(fù)，在某些類型的細胞中比其他細胞更頻繁地發(fā)生，并且需要存在可用于修補破裂的DNA片段。研究人員經(jīng)常提供單鏈DNA，并希望細胞使用它來用新的序列替換錯誤的序列。

然而，這兩個過程都有點神秘，沒有人知道為什么有些細胞很容易在DNA中修補，而其他細胞很少這樣做。

“將CRISPR-Cas9用于醫(yī)學(xué)或合成生物學(xué)應(yīng)用的熱情非常高，但沒有人真正知道將它放入細胞后會發(fā)生什么，”理查森說。“它會創(chuàng)造這些中斷并依靠細胞來修復(fù)它們。但人們并不真正理解這個過程是如何運作的。”

為了找出哪些DNA修復(fù)酶對CRISPR切割后的同源定向修復(fù)至關(guān)重要，Richardson和Corn采用了一種稱為CRISPR干擾(CRISPRi)的技術(shù)，一次一個地敲除已知或懷疑參與的2,000多個基因。 DNA修復(fù)，對健康細胞至關(guān)重要的功能。

令人驚訝的是，許多被證明是重要同源導(dǎo)向修復(fù)的基因在沉默后顯著下降 - 參與了一個不被認為參與CRISPR修復(fù)的重要修復(fù)系統(tǒng)。

范可尼貧血癥

該途徑涉及21種不同的蛋白質(zhì)，被稱為Fanconi貧血途徑，因為如果這些蛋白質(zhì)的任何基因受損，人們會發(fā)展出Fanconi貧血癥，這是一種罕見但嚴重的遺傳性疾病，其中骨髓不能產(chǎn)生足夠的新血細胞。它與出生缺陷和高風(fēng)險癌癥有關(guān)，包括在童年時發(fā)生白血病的幾率為10%。很少有患者活到30歲以上。

該途徑已知并研究了數(shù)十年，但人們普遍認為它可以修復(fù)一種特定類型的DNA損傷：DNA鏈間交聯(lián)，其中一條DNA鏈上的核苷酸與相鄰鏈上的核苷酸緊密結(jié)合，干擾DNA復(fù)制并經(jīng)常殺死細胞。研究人員在20世紀80年代報道了同源定向修復(fù)與Fanconi貧血途徑之間的聯(lián)系，但它被忽視或誤解，Corn指出。

“基于我們的工作，我們認為Fanconi貧血途徑在修復(fù)其他類型的病變方面起著重要作用，但最好將其理解為修復(fù)雙鏈斷裂的途徑，”Richardson說。“Cas9編輯后，如果你想插入新DNA，就需要Fanconi貧血途徑。”

然而，F(xiàn)anconi貧血途徑在修復(fù)CRISPR斷裂中的重要性使人懷疑一些計劃的CRISPR治療方法本身。沒有活躍的Fanconi貧血途徑，在Cas9切割后，細胞可能無法用正?；蛱鎿Q其突變基因。

事實上，F(xiàn)anconi貧血途徑的活性水平可能會影響CRISPR在特定細胞中插入DNA的效率。研究人員得出結(jié)論，雖然末端連接是雙鏈斷裂后的默認修復(fù)機制，但Fanconi貧血途徑與其競爭，并且更高的活性導(dǎo)致更多的同源定向修復(fù)和更少的末端連接。

癌癥治療

雖然這些發(fā)現(xiàn)有助于科學(xué)家更好地理解人體細胞中的DNA修復(fù)機制，但它們也可以幫助研究人員開發(fā)針對癌細胞中DNA修復(fù)的抗癌療法。由于其他因素現(xiàn)在似乎與修復(fù)雙??鏈斷裂有關(guān)，因此本研究擴大了可能被錯誤調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)列表，以便加劇癌細胞中的DNA修復(fù)并使其更容易死亡。

Richardson還發(fā)現(xiàn)該途徑中的21種蛋白質(zhì)之一FANCD2始終位于CRISPR-Cas9產(chǎn)生的雙鏈斷裂位點，表明它在調(diào)節(jié)新DNA插入基因組中起重要作用。削減網(wǎng)站?？梢哉{(diào)整FANCD2以提高細胞通過同源定向修復(fù)插入DNA的頻率。

“此外，由于FANCD2本地化為Cas9中斷站點，因此您可以使用FANCD2映射Cas9在任何細胞類型中切割的位置，”Richardson說。“如果您編輯一組細胞，并且想要了解目標和非目標切割的位置，您只需繪制基因組中FANCD2的位置，即可找到切割位置。”

“整個Fanconi貧血途徑影響終端連接和同源定向修復(fù)之間的平衡;它就像一個交通警察，”Corn說。“因此，患者的基因型將影響您進行基因編輯的方式。”