本技術(shù)涉及免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方

法，包括制備抗體標(biāo)被；對(duì)BDNF板和Prolaction板分別進(jìn)行澆注、封閉、洗滌、晾干后，再

保存起來(lái)待用；配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，作為空白液；配制樣本稀釋液；將BDNF板和Prolaction板

放入孵育振蕩器中孵育抗體；加入檢測(cè)抗體后加入試劑盒SAHRP中；放在酶標(biāo)儀下讀取光

密度OD值；繪制BDNF和prolactin的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)算稀釋樣品的回收率。本技術(shù)有效

解決了背景值偏高，信噪比低，靈敏度低，并且具有降低基質(zhì)效應(yīng)所產(chǎn)生的干擾，使檢測(cè)結(jié)

果更加穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。

權(quán)利要求書

1.一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，其特征在于，包含如下步驟：

第一步，制備抗體包被；

將捕獲的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子抗體加入碳酸鹽緩沖液中，并且將其加入ELISA板的孔中，標(biāo)

記為BNDF板，置于2-8℃的溫度下包被16-24小時(shí)；

進(jìn)一步地，將催素抗體加入另一組碳酸鹽緩沖液中，并且將其加入ELISA板的孔中，標(biāo)記

為催素板，置于2-8℃的溫度下包被16-24個(gè)小時(shí)；

第二步，對(duì)第一步中的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板分別進(jìn)行澆注、封閉、洗滌、晾干

后，再保存起來(lái)待用；

將PH值為7.4±0.2的含有5％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液向第一步中的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

板和催素板分別澆注；或者將PH值為7.4±0.2的含有5-10％脫脂奶粉向第一步中的腦源性

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板分別澆注；

進(jìn)一步地，將該澆注好的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板分別放在2-8℃的溫度下封閉放

置16-24小時(shí)；

進(jìn)一步地，用含有非離子型表面活性劑的PBS溶液對(duì)封閉好的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催

素板進(jìn)行洗滌、晾干后，置于2-8℃的溫度下保存待用；

第三步，配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，作為空白液；

首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，

并且攪拌均勻；

進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑，攪拌均勻后作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，即空

白液；

第四步，配制樣本稀釋液；

樣本稀釋液1：首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸

鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2％表面活性劑3-[3-(膽酰氨丙基)

二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪

拌均勻；

樣本稀釋液2：首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸

鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2％的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨

基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步的，向該溶液中加入5mmol/l的螯合劑乙二胺四乙酸攪拌均

勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪拌均勻；

樣本稀釋液3：首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸

鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2％的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨

基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)

一步地，向該溶液中加入0.05％牛血清γ球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的液體防腐劑攪拌均勻；

樣本稀釋液4：首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸

鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2％的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨

基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)

一步地，向該溶液中加入0.10％牛血清γ球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的液體防腐劑攪拌均勻；

樣本稀釋液5：首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸

鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2％的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨

基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)

一步地，向該溶液中加入0.15％牛血清γ球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的液體防腐劑攪拌均勻；

樣本稀釋液6：首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸

鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2％的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨

基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)

一步地，向該溶液中加入0.20％牛血清γ球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的液體防腐劑攪拌均勻；

樣本稀釋液7：首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸

鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2％的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨

基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)

一步地，向該溶液中加入0.25％牛血清γ球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的液體防腐劑攪拌均勻；

第五步，將腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板放入孵育振蕩器中孵育抗體；

分別將第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，重復(fù)的

分別加入第二步中晾干后待用的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板的孔中，再向各個(gè)反應(yīng)孔

中加入處理酶，

進(jìn)一步地，將加好溶液的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板放入孵育振蕩器中，在18-25℃

的室溫條件下反應(yīng)；

第六步，加入檢測(cè)抗體；

用含有Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第五步中反應(yīng)后的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板分

別洗滌，再相應(yīng)的向BDNF板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子檢測(cè)抗體，并且相應(yīng)

的向催素板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入催素檢測(cè)抗體；

第七步，將稀釋液加入試劑盒中；

用含有Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板分

別洗滌后對(duì)其進(jìn)行稀釋，再分別向該試劑盒中的每個(gè)孔中加入稀釋后的溶液；

第八步，放在酶標(biāo)儀下讀取光密度值；

用含有Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第七步中反應(yīng)后的試劑盒分別洗滌，再向該洗滌好的試

劑盒中加入四甲基聯(lián)苯胺底物；

進(jìn)一步地，將加好TMB的試劑盒放在酶標(biāo)儀下讀取光密度值；

第九步，根據(jù)光密度值計(jì)算出非特異性吸附數(shù)據(jù)，通過比較非特異性吸附數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定

出牛血清γ球蛋白作為抗原對(duì)降低背景噪音具有直接并且積極的作用；

首先，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，在腦源

性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果；

進(jìn)一步地，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，在

催素板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果；

進(jìn)一步地，發(fā)現(xiàn)在稀釋液中加入牛血清γ球蛋白的樣本稀釋液3-7，在兩種包被不同抗體的

ELISA板，即神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催素板中的非特異性吸附NSB都很小，從而說(shuō)明所產(chǎn)生的

背景值都非常低，為0.02-0.045之間；

進(jìn)一步地，由于樣本稀釋液3-7中的牛血清γ球蛋白濃度不同，但是都降低了ELISA反應(yīng)中的

背景信號(hào)；

進(jìn)一步地，說(shuō)明牛血清γ球蛋白抗原對(duì)降低背景噪音具有直接且積極的作用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，還包含：第十

步，將該第四步中的樣本稀釋液6作為新的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，僅將該3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]

丙磺酸內(nèi)鹽的含量分別調(diào)整為0.1％、0.15％、0.25％、0.3％、0.45％、0.5％、0.6％，從而

形成7種新的樣本稀釋液8-14，其它步驟完全按照第一步至八步進(jìn)行處理，讀取光密度值，

進(jìn)一步計(jì)算出非特異性吸附系數(shù)；并對(duì)測(cè)得的非特異性吸附系數(shù)進(jìn)行分析，得出在牛血清γ

球蛋白含量一定的情況下，3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽濃度位于0.2％-0.45％之

間時(shí)，腦源性神經(jīng)因子板和催素板的非特異性吸附都會(huì)降低，從而使背景信號(hào)降低。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，還包含：第十

一步，從第四步和第十步中選取出三種信噪比高，非特異性信號(hào)低的三種樣本稀釋液來(lái)繪制

BDNF和prolactin的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)算稀釋樣品的回收率；根據(jù)測(cè)試結(jié)果證明了向含有

牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中分別加入0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂、0.2-0.45％

的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、5mmol/l的乙二胺四乙酸、任意濃度的牛血清γ球

蛋白、百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀

釋液，具體步驟為：

首先，分別將腦源性神經(jīng)因子和催素標(biāo)準(zhǔn)抗原加入腦源性神經(jīng)因子和催素陰性血清中；

進(jìn)一步地，分別對(duì)配制好的陰性血清進(jìn)行稀釋，稀釋后分別加入三種信噪比高，非特異性信

號(hào)低的樣本稀釋液3、樣本稀釋液10、樣本稀釋液12中，其他步驟與第五步至第八步完全一

致，讀出光密度值和回收率；

進(jìn)一步地，樣本稀釋液3和樣本稀釋液12分別是3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽為

0.2％和0.45％的2個(gè)臨界點(diǎn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明三種樣本稀釋液3、10、12配制的腦源性神經(jīng)因子

和催素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別互相平行，相關(guān)性很好，并且與陰性血清相比回收率提高；

進(jìn)一步地，證明向PH值為7.4±0.2的含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中分別加入0.05％聚

氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂、0.2-0.45％的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、5mmol/l

的乙二胺四乙酸、0.05％-0.2％的牛血清γ球蛋白、百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑作為稀釋液，

是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀釋液。

技術(shù)說(shuō)明書

一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法

技術(shù)領(lǐng)域

本技術(shù)涉及免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方

法。

背景技術(shù)

ELISA是酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡(jiǎn)稱，是繼免疫熒光

和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。由于ELISA的實(shí)驗(yàn)方法具有敏感、特異、

經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、安全等特點(diǎn)，因此是目前免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種檢測(cè)方法。

ELISA操作過程中選用優(yōu)質(zhì)的試劑、良好的儀器以及正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確

可靠的必要條件，ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)一般均采

用板式點(diǎn)。

無(wú)論ELISA技術(shù)如何發(fā)展,更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，更高的數(shù)據(jù)可重復(fù)性始終是廣大科研工作

者追求的目標(biāo)。建立一個(gè)好的ELISA方法的基礎(chǔ)是首先要找到好的抗原與抗體，然而目前該

技術(shù)仍然面臨許多問題和挑戰(zhàn)：(1)靈敏度有待提高，ELISA方法在醫(yī)院，藥企和科研院所被

應(yīng)用于與疾病相關(guān)的各種因子的檢測(cè)，這些因子往往都是一些內(nèi)源性的細(xì)胞因子、趨化分

子、粘附分子等等，然而有些內(nèi)源性分子表達(dá)風(fēng)度低，難于被檢測(cè)，高靈敏度的試劑盒有利

于解決這個(gè)問題。(2)基質(zhì)效應(yīng)問題，ELISA所檢測(cè)的樣本的基質(zhì)種類多種多樣，不同基質(zhì)成

分、物理性質(zhì)不同，會(huì)對(duì)樣本檢測(cè)產(chǎn)生干擾，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確或不穩(wěn)定；并且在內(nèi)源性因

子的定量檢測(cè)中，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖液和待測(cè)樣本真實(shí)基質(zhì)間的客觀差異也會(huì)影響到最后

的檢測(cè)結(jié)果。(3)非特異性吸附，非特異性吸附的原因復(fù)雜，其中一個(gè)結(jié)果就是導(dǎo)致空白的

背景值偏高，信噪比偏低，從而影響了整個(gè)試劑盒的定量靈敏度。

酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清、血漿或其它基質(zhì)樣本不稀釋，不可避免

會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此，由于待測(cè)樣本機(jī)制的復(fù)雜性也可能造成基

質(zhì)效應(yīng)，干擾檢測(cè)結(jié)果。

因此，免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域急需一種降低背景值偏高，提高信噪比，增加靈敏度，消除基質(zhì)效

應(yīng)所產(chǎn)生的干擾，使檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠的ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方

法。

技術(shù)內(nèi)容

本技術(shù)提供了一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，技術(shù)方案如下：

一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，其特征在于，包含如下步驟：

第一步，制備抗體包被；

將捕獲的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF抗體加入碳酸鹽緩沖液中，并且將其加入ELISA板的孔

中，標(biāo)記為BNDF板，置于2-8℃的溫度下包被16-24小時(shí)；

進(jìn)一步地，將催素Prolactin抗體加入另一組碳酸鹽緩沖液中，并且將其加入ELISA板的孔

中，標(biāo)記為Prolaction板，置于2-8℃的溫度下包被16-24個(gè)小時(shí)；

第二步，對(duì)第一步中BDNF板和Prolaction板分別進(jìn)行澆注、封閉、洗滌、晾干后，再保存起

來(lái)待用；

將PH值為7.4±0.2的含有5％牛血清白蛋白BSA的磷酸鹽緩沖液PBS向第一步中的BNDF板和

Prolaction板分別澆注；或者將PH值為7.4±0.2的含有5-10％脫脂奶粉向第一步中的BNDF板和

Prolaction板分別澆注；

進(jìn)一步地，將該澆注好的BDNF板和Prolaction板分別放在2-8℃的溫度下封閉放置16-24小

時(shí)；

進(jìn)一步地，用含有非離子型表面活性劑Tween20的PBS溶液對(duì)封閉好的BDNF板和Prolaction

板進(jìn)行洗滌、晾干后，置于2-8℃的溫度下保存待用；

第三步，配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，作為空白液；

首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均

勻；

進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑Proclin，攪拌均勻后作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋

液，即空白液；

第四步，配制樣本稀釋液；

樣本稀釋液1：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％表面活性劑3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽CHAPS攪拌均

勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液2：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步的，向該溶液中加入5mmol/l的螯合劑乙

二胺四乙酸EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液3：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.05％牛血清γ-球蛋白BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加

入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液4：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.10％BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液5：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.15％BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液6：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.20％BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液7：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.25％BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的Proclin攪拌均勻；

第五步，將BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中孵育抗體；

分別將第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，重復(fù)的

分別加入第二步中晾干后待用的BDNF板和Prolaction板的孔中，再向各個(gè)反應(yīng)孔中加入處理

酶；

進(jìn)一步地，將加好溶液的BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中，在18-25℃的室溫條件下

反應(yīng)；

第六步，加入檢測(cè)抗體；

用含有Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第五步中反應(yīng)后的BDNF板和Prolaction板分別洗滌，再

相應(yīng)的向BDNF板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入BDNF檢測(cè)抗體，并且相應(yīng)的向Prolaction板的每個(gè)反

應(yīng)孔中加入Prolaction檢測(cè)抗體；

第七步，將稀釋液加入試劑盒中；

用含有Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的BDNF板和Prolaction板分別洗滌后對(duì)

其進(jìn)行稀釋，再分別向試劑盒SA-HRP中的每個(gè)孔中加入稀釋后的溶液；

第八步，放在酶標(biāo)儀下讀取光密度OD值；

用含有Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第七步中反應(yīng)后的試劑盒SA-HRP分別洗滌，再向該洗

滌好的試劑盒SA-HRP中加入四甲基聯(lián)苯胺TMB底物；

進(jìn)一步地，將加好TMB的試劑盒SA-HRP放在酶標(biāo)儀下讀取OD值；

第九步，根據(jù)OD值計(jì)算出非特異性吸附數(shù)據(jù)，通過比較非特異性吸附數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定出

牛血清γ球蛋白BGG作為抗原對(duì)降低背景噪音具有直接并且積極的作用。

首先，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7和一份正常人血清樣本，在BDNF

板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果；

進(jìn)一步地，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7和一份正常人血清樣本，在

Prolactin板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果；

進(jìn)一步地，發(fā)現(xiàn)在稀釋液中加入牛血清γ球蛋白BGG的樣本稀釋液3-7，在兩種包被不同抗體

的ELISA板，即BNDF板、Prolactin板中的非特異性吸附NSB都很小，從而說(shuō)明所產(chǎn)生的背景

值都非常低；

進(jìn)一步地，由于樣本稀釋液3-7中的BGG濃度不同，但是都降低了ELISA反應(yīng)中的背景信

號(hào)；

進(jìn)一步地，說(shuō)明任意濃度的牛血清γ球蛋白BGG抗原對(duì)降低背景噪音具有直接且積極的作

用。

如上所述的一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，還包含：第十步，將第四

步中的樣本稀釋液6作為新的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，僅將CHAPS的含量分別調(diào)整為0.1％、0.15％、

0.25％、0.3％、0.45％、0.5％、0.6％，從而形成7種新的樣本稀釋液8-14，其它步驟完全按

照第一步至八步進(jìn)行處理，讀取OD值，進(jìn)一步計(jì)算出非特異性吸附系數(shù)；并對(duì)測(cè)得的非特

異性吸附系數(shù)進(jìn)行分析，得出在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情況下，CHAPS濃度位于

0.2％-0.45％之間時(shí)，BDNF板和Prolactin板的非特異性吸附NSB都會(huì)降低，從而使背景信號(hào)

降低。

如上所述的一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，還包含：第十一步，從第

四步和第十步中選取出三種信噪比高，非特異性信號(hào)低的三種樣本稀釋液來(lái)繪制BDNF和

prolactin的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)算稀釋樣品的回收率；根據(jù)測(cè)試結(jié)果證明了向含有5％BSA的

PBS中分別加入0.05％Tween20、0.2-0.45％CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意濃度的牛血清γ

球蛋白BGG、百萬(wàn)分之十五的Proclin作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本

稀釋液，具體步驟為：

首先，分別將BDNF和Prolactin標(biāo)準(zhǔn)抗原加入BDNF和prolactin陰性血清中；

進(jìn)一步地，向該陰性血清樣本中分別加入樣本稀釋液3、樣本稀釋液10、樣本稀釋液12中其

他步驟與第五步至第八步完全一致，讀出光密度OD值和回收率；

進(jìn)一步地，兩種樣本稀釋液3和樣本稀釋液12分別是CHAPS為0.2％和0.45％的2個(gè)臨界點(diǎn)，

經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明三種樣本稀釋液3、10、12配制的BDNF和Prolactin的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別互相平行，相

關(guān)性很好，并且與陰性血清相比回收率提高；

進(jìn)一步地，證明向PH值為7.4±0.2的含有5％BSA的PBS中分別加入0.05％Tween20、0.2-

0.45％CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意濃度的牛血清γ球蛋白BGG、百萬(wàn)分之十五的Proclin

作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀釋液。

本技術(shù)的有益效果是：

1.本技術(shù)用牛血清γ球蛋白BGG作為抗原，從而起到降低背景噪音的作用。

2.本技術(shù)確定了在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情況下，CHAPS濃度位于0.2％-0.45％之間

時(shí)，BDNF板和Prolactin板的非特異性吸附NSB都會(huì)降低，降低了背景信號(hào)。

3.本技術(shù)提供了一種非常好的適用于ELISA的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液，彌補(bǔ)了行業(yè)的空

白，促進(jìn)科學(xué)進(jìn)步。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本技術(shù)：

圖1是本技術(shù)BDNF在三種稀釋液中的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2是本技術(shù)Prolactin在三種稀釋液中的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為了使本技術(shù)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，

進(jìn)一步闡述本技術(shù)。

本技術(shù)提供了一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，具體步驟如下：

第一步，制備抗體包被；

將捕獲的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF抗體加入PH值為9.6的0.05mol/l碳酸鹽緩沖液中，配制成

濃度為2μg/ml的溶液，并且將其加入ELISA板的孔中，標(biāo)記為BNDF板，置于2-8℃的溫度下

包被16-24小時(shí)；

進(jìn)一步地，將催素Prolactin抗體加入另一組PH值為9.6的0.05mol/l碳酸鹽緩沖液中，配制成

濃度為2.5μg/ml的溶液，并且將其加入ELISA板的孔中，標(biāo)記為Prolaction板，置于2-8℃的溫

度下包被16-24個(gè)小時(shí)；

第二步，對(duì)第一步中BDNF板和Prolaction板分別進(jìn)行澆注、封閉、洗滌、晾干后，再保存起

來(lái)待用；

將PH值為7.4±0.2的含有5％牛血清白蛋白BSA的磷酸鹽緩沖液PBS向第一步中的BNDF板和

Prolaction板分別澆注，每個(gè)孔中澆注300μl；或者將PH值為7.4±0.2的含有5-10％脫脂奶粉向

第一步中的BNDF板和Prolaction板分別澆注，每個(gè)孔中澆注300μl；

進(jìn)一步地，將該澆注好的BDNF板和Prolaction板分別放在2-8℃的溫度下封閉放置16-24小

時(shí)；

進(jìn)一步地，用含有0.05％非離子型表面活性劑Tween的PBS溶液對(duì)封閉好的BDNF板和

Prolaction板進(jìn)行洗滌、晾干后，置于2-8℃的溫度下保存待用；

第三步，配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，作為空白液；

首先將0.05％聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均

勻；

進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑Proclin，攪拌均勻后作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋

液，即空白液；

第四步，配制樣本稀釋液；

樣本稀釋液1：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％表面活性劑3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽CHAPS攪拌均

勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液2：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步的，向該溶液中加入5mmol/l的螯合劑乙

二胺四乙酸EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液3：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.05％牛血清γ-球蛋白BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加

入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液4：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.10％BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液5：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.15％BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液6：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.20％BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的Proclin攪拌均勻；

樣本稀釋液7：首先將0.05％Tween20加入含有5％BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步

地，向該溶液中加入0.2％CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪

拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.25％BGG；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五

的Proclin攪拌均勻；

第五步，將BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中孵育抗體；

分別將第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，以10個(gè)

重復(fù)分別加入第二步中晾干后待用的BDNF板和Prolaction板的孔中，再向各個(gè)反應(yīng)孔中加入

100μl處理酶，

進(jìn)一步地，將加好溶液的BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中，以500轉(zhuǎn)/分的速度在18-

25℃的室溫條件下反應(yīng)2小時(shí)。

第六步，加入檢測(cè)抗體；

用含有0.05％Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第五步中反應(yīng)后的BDNF板和Prolaction板分別洗滌

4次，再相應(yīng)的向BDNF板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl的BDNF檢測(cè)抗體，并且相應(yīng)的向

Prolaction板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl的Prolaction檢測(cè)抗體；

第七步，將稀釋液加入試劑盒中；

用含有0.05％Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的BDNF板和Prolaction板分別洗滌

4次，再以1:10000對(duì)其進(jìn)行稀釋后，分別向試劑盒SA-HRP中的每個(gè)孔中加入100μl的稀釋后

的溶液；

第八步，放在酶標(biāo)儀下讀取光密度OD值；

用含有0.05％Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第七步中反應(yīng)后的試劑盒SA-HRP分別洗滌4次，

再向該洗滌好的試劑盒SA-HRP中加入四甲基聯(lián)苯胺TMB底物；

進(jìn)一步地，將加好TMB的試劑盒SA-HRP放在波長(zhǎng)為450nm的酶標(biāo)儀下讀取OD值；

第九步，根據(jù)OD值計(jì)算出非特異性吸附數(shù)據(jù)，通過比較非特異性吸附數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定出

牛血清γ球蛋白BGG作為抗原對(duì)降低背景噪音具有直接并且積極的作用；

首先，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，在BDNF

板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果，如表一：

表一

進(jìn)一步地，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，在

Prolactin板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果，如表二：

表二

根據(jù)上述表一和表二中的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在稀釋液中加入牛血清γ球蛋白BGG的樣本稀

釋液3-7，在兩種包被不同抗體的ELISA板，即BNDF板、Prolactin板中的非特異性吸附NSB

都很小，從而說(shuō)明所產(chǎn)生的背景值都非常低，為0.02-0.05之間；

進(jìn)一步地，由于樣本稀釋液3-7中的BGG濃度不同，但是都降低了ELISA反應(yīng)中的背景信

號(hào)；

進(jìn)一步地，說(shuō)明牛血清γ球蛋白BGG抗原對(duì)降低背景噪音具有直接且積極的作用；

第十步，將第四步中的樣本稀釋液6作為新的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，僅將CHAPS的含量分別調(diào)整為

0.1％、0.15％、0.25％、0.3％、0.45％、0.5％、0.6％，從而形成7種新的樣本稀釋液8-14。

其它步驟完全按照第一步至八步進(jìn)行處理，讀取OD值；

第十一步，根據(jù)OD值計(jì)算出非特異性吸附NSB的值，從而得到在牛血清γ球蛋白BGG含量一

定的情況下，CHAPS濃度位于0.2％-0.45％之間時(shí)，BDNF板和Prolactin板的非特異性吸附

NSB都會(huì)降低，從而使背景信號(hào)的降低；

第十步中的樣本稀釋液6、樣本稀釋液8-14和一份正常人血清樣本在BDNF板上所測(cè)得的非特

異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果，如表三：

表三

進(jìn)一步地，第十步中的樣本稀釋液6、樣本稀釋液8-14、一份正常人血清樣本，在Prolactin板

上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果，如表四：

表四

EDTA，Tween20皆為本領(lǐng)域常用添加劑，但CHAPS并不是大家普遍使用的添加劑。因此，

根據(jù)上述表三和表四中的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情況

下，CHAPS濃度位于0.2％-0.45％之間時(shí)，BDNF板和Prolactin板的非特異性吸附NSB都會(huì)降

低，從而使背景信號(hào)的降低；

第十二步，從第四步和第十步中選取出三種信噪比高，非特異性信號(hào)低的三種樣本稀釋液來(lái)

繪制BDNF和prolactin的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)算稀釋樣品的回收率；圖1是本技術(shù)BDNF在

三種稀釋液中的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖2是本技術(shù)Prolactin在三種稀釋液中的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲

線；根據(jù)測(cè)得的回收率證明了向含有5％BSA的PBS中分別加入0.05％Tween20、0.2-

0.45％CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意濃度的牛血清γ-球蛋白BGG、百萬(wàn)分之十五的Proclin

作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀釋液。

首先，分別將4000pg/ml的BDNF和Prolactin標(biāo)準(zhǔn)抗原加入BDNF和prolactin陰性血清中；

進(jìn)一步地，分別以1:2，1:4，1:8對(duì)配制好的陰性血清進(jìn)行稀釋，稀釋后分別加入樣本稀釋液

3、樣本稀釋液10、樣本稀釋液12中，其他步驟與第五步至第八步完全一致，讀出光密度OD

值，進(jìn)一步的計(jì)算出回收率，并且根據(jù)回收率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖1是本技術(shù)BDNF在三種稀

釋液中的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖2是本技術(shù)Prolactin在三種稀釋液中的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線；

三種樣本稀釋液所配制BDNF標(biāo)準(zhǔn)曲線的光密度OD值與回收率，如表五：

表五

三種樣本稀釋液所配制Prolactin標(biāo)準(zhǔn)曲線的光密度OD值與回收率，如表六：

表六

進(jìn)一步地，以陰性血清樣本作為對(duì)照，比較樣本稀釋液的平均回收率；

BDNF在三種樣本稀釋液中的平均回收率，如表七：

表七

prolactin在三種樣本稀釋液中的平均回收率，如表八：

表八

根據(jù)對(duì)表五、六、七、八的分析，兩種樣本稀釋液3和樣本稀釋液12分別是CHAPS為0.2％和

0.45％的2個(gè)臨界點(diǎn)；經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明三種樣本稀釋液3、10、12配制的BDNF和Prolactin的標(biāo)準(zhǔn)曲

線分別互相平行，相關(guān)性很好；用這三種樣本稀釋液來(lái)分別稀釋含有BDNF和Prolactin的血

清樣本，與陰性血清樣本相比，其回收率從65-77％提高到85-115％，回收率有了大大的提

高，結(jié)果準(zhǔn)確度提高，從而滿足檢測(cè)的要求；

進(jìn)一步地，證明向PH值為7.4±0.2的含有5％BSA的PBS中分別加入0.05％Tween20、0.2-

0.45％CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意濃度的牛血清γ球蛋白BGG、百萬(wàn)分之十五的Proclin

作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀釋液。

本技術(shù)用牛血清γ球蛋白BGG作為抗原，從而起到降低背景噪音的作用。

本技術(shù)確定了在牛血清γ球蛋白BGG含量一定的情況下，CHAPS濃度位于0.2％-0.45％之間

時(shí)，BDNF板和Prolactin板的非特異性吸附NSB都會(huì)降低，降低了背景信號(hào)。

本技術(shù)提供了一種非常好的適用于ELISA的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液，彌補(bǔ)了行業(yè)的空白，

促進(jìn)科學(xué)進(jìn)步。

以上顯示和描述了本技術(shù)的基本原理、主要特征和本技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了

解，本技術(shù)不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本技術(shù)的原理，

在不脫離本技術(shù)精神和范圍的前提下本技術(shù)還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入

要求保護(hù)的本技術(shù)范圍內(nèi)。本技術(shù)要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。