220實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與

比較更-學(xué)LaboratoryAnimalandComparative

Medicine

Jun.2019,39

(3)

doi:10.3969/.l674-5817.2019.03.008

小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人HepG2細(xì)胞

殺傷活性檢測(cè)方法的建立

陳麗玲，鐘友寶，劉漩，陳來,袁可望，黃麗婷，李?yuàn)檴?/p>

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌330004)

［摘要］

目的在建立既能保留人腫瘤生物學(xué)特性的，且免疫功能相對(duì)正常的人腫瘤異種移植動(dòng)

物模型的過程中，為保證小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞殺傷作用的考察效率，摸索建立基于流式

細(xì)胞術(shù)的評(píng)價(jià)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人HepG2細(xì)胞殺傷活性的方法。方法用竣基熒光素二乙酸鹽

琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記人HepG2細(xì)胞，利用無水乙醇模擬殺傷人HepG2細(xì)胞，用碘化丙唳(PI)

染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，確定CFSE和PI的濃度及作用時(shí)間。以小鼠脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，人HepG2

細(xì)胞為靶細(xì)胞，從效靶作用時(shí)間和效靶比方面進(jìn)行優(yōu)化，確定試驗(yàn)方法的最佳條件。結(jié)果采用

CFSE/PI雙標(biāo)記將細(xì)胞分為CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+和CFSE-PI-4個(gè)組，可有效區(qū)分活

細(xì)胞和被殺傷細(xì)胞。CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞的濃度采用2.5pmol/mL，效靶作用時(shí)間為12h,效靶比

10：1。結(jié)論建立了基于流式細(xì)胞術(shù)的評(píng)價(jià)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人HepG2細(xì)胞殺傷活性的方法，

該方法的建立可為評(píng)價(jià)動(dòng)物脾淋巴細(xì)胞對(duì)異種細(xì)胞的殺傷作用提供參考。

［關(guān)鍵詞］小鼠；脾淋巴細(xì)胞；人HepG2細(xì)胞；竣基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE);

碘化丙呢

(PI)；細(xì)胞毒活性

［中圖分類號(hào)］R392.33Q95-33［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］1674-5817(2019)03-0220-06

從動(dòng)物模梨與臨床實(shí)際腫瘤的相近性而言，現(xiàn)

有腫瘤動(dòng)物模烈中，人腫瘤的異種移植模烈是最貝有

的)相遇與其對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞克隆即被破壞或抑制,

出生后只對(duì)胚胎期曾接觸過的抗原形成耐受,而對(duì)胚

胎時(shí)期從未接觸過的抗原仍有免疫應(yīng)答⑶”,在具有應(yīng)用價(jià)值和前景的。而現(xiàn)有成熟的以免疫缺陷動(dòng)物

作為載體的人源腫瘤模型存在短板:無胸腺裸小鼠的

T

細(xì)胞生成障礙導(dǎo)致其無法用于移植腫瘤與特異性

完善免疫系統(tǒng)的KM小鼠基礎(chǔ)上，建立適用于人來源

的、且免疫功能相対正常的人腫瘤異種移植動(dòng)物模

烈，以達(dá)到為腫瘤研究,尤其是腫瘤免疫研究提供新

免疫系統(tǒng)相互作用的研究

［1，2］。因此，建立既能保留

人源腫瘤生物學(xué)特性，又貝有正常免疫功能的動(dòng)物模

烈是腫瘤研究,尤其是腫瘤免疫研究急需解決的問題。

的臨床前研究模烈的目的。在模梨建立初期，我們

擬向孕鼠子宮內(nèi)的胎鼠注射人肝癌HepG2細(xì)胞，之

后在成功出生且存活的胎鼠肝臟原位移植人肝癌

HepG2細(xì)胞,評(píng)價(jià)成瘤效果，并考察荷瘤小鼠的免疫

功能和對(duì)HepG2細(xì)胞及其他人腫瘤瘤株的排斥情

我們擬利用“獲得性免疫耐受”的機(jī)制，

即“在胚

胎時(shí)期，體內(nèi)已有的針対多種抗原具有免疫活性的淋

巴細(xì)胞克隆,若與某種抗原(包括自身的或人工導(dǎo)入

［收稿日期］2018-12-24

［基金項(xiàng)目

］

江西省青年科學(xué)基金(20161BAB215214);江西省

況。在考察小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人肝癌HepG2

細(xì)胞

殺傷作用的過程中，計(jì)劃檢測(cè)樣本量較大，因此需要

建立一種操作方便、快速的檢測(cè)方法。目前經(jīng)常

教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目基金(GJJ14623)

［作者簡(jiǎn)介］陳麗玲(1983-),女,碩上，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)及免

疫研究。E-mail:465993116@

使用的細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)方法中，經(jīng)典的51Cr釋放法

存在自然釋放率較高、放射性會(huì)対細(xì)胞及操作人員

［通信作者］李?yuàn)檴?1982-),女，博士,主要從事腫瘤藥理、安

全理和毒理研究。Bmail:7M596948@

造成傷害等不足;酸脫氫酶(LDH)釋放法因影響因

素較多和背景信號(hào)的干擾等問題，應(yīng)用有限［4］；酶聯(lián)

Jun.2019,39(3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)LaboratoryAnimalandComparativeMedicine221

免疫斑點(diǎn)（Enzyme-linkedimmunospot,ELISPOT）檢

測(cè)技術(shù)、主要組織相容性復(fù)合體（Majorhistocom-

patibilitycomplex,MHC）四聚體顯示T細(xì)胞受體的染

技術(shù)和胞內(nèi)細(xì)胞因子染等技術(shù)，只能通過間接檢

測(cè)T細(xì)胞表面受體或細(xì)胞因子的水平反應(yīng)細(xì)胞毒性

T淋巴細(xì)胞（CytotoxicTlymphocytes,CTL）活性［5］。

竣基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯

（Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,

CFSE）是一種本身不發(fā)熒光的活體染料，它可穿透

細(xì)胞膜，被胞內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化成具有綠熒光的氨基反

應(yīng)性竣基熒光素琥珀酰亞胺酯，同時(shí)失去自山透過

細(xì)胞的能力，可穩(wěn)定標(biāo)示活細(xì)胞［

6-8］。碘化丙喘

（Propidiumiodide,PI）是一種可對(duì)DNA染的細(xì)胞

核染試劑

，其不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破

損的細(xì)胞膜，嵌入雙鏈DNA后釋放紅熒光。

在

效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合前，先將靶細(xì)胞用CFSE

染

，染后的靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞混合作用后，再用

PI染，采用流式細(xì)胞術(shù)即可區(qū)分被殺傷靶細(xì)胞

及存活靶細(xì)胞，并體現(xiàn)效應(yīng)細(xì)胞的死亡情況，測(cè)

定效應(yīng)細(xì)胞対靶細(xì)胞的殺傷活性，且檢測(cè)速度較快。

本實(shí)驗(yàn)擬建立基于流式細(xì)胞術(shù)的評(píng)價(jià)小鼠脾淋

巴細(xì)胞對(duì)人HepG2細(xì)胞殺傷活性的方法，以準(zhǔn)確

檢測(cè)模烈小鼠脾細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，4周齡，體質(zhì)量18~22g,

購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（湘）

2013-0004］。飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技

中心［SYXK（贛）2017-0004］。實(shí)驗(yàn)獲得江西中醫(yī)藥

大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理審杳證號(hào)：

JZLLSC207-0021）,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則

給予人道主義關(guān)懷。

1.2細(xì)胞株

人肝癌

HepG2細(xì)胞山江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與

民族藥研究中心惠贈(zèng)（購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

1.3藥品及主要試劑

CFSE（批號(hào)為S8269）購自美國Selleck生物科技

有限公司；PI（批號(hào)為2018/12）購自合肥新恩源生物

技術(shù)有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffer

saline,PBS）（批號(hào)為20171108）、DMEM高糖培養(yǎng)

基（含雙抗，

青霉素100U/mL,

鏈霉素100|lg/mL）

（批號(hào)為20170812）和胎牛血清（批號(hào)為RY3201）均購

自天津市澈洋生物制品科技有限責(zé)任公司;紅細(xì)胞裂

解液（批號(hào)為20170731）、胰蛋白酶（批號(hào)為T1300）

和臺(tái)盼藍(lán)染液（批號(hào)為:20161122）均購自北京索萊寶

科技有限公司。

1.4主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)為C150）購自德國賓德有限責(zé)

任公司，流式細(xì)胞儀（型號(hào)為FACSVerse）購自美國

BD醫(yī)療器械有限公司。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1靶細(xì)胞人肝癌HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)人肝癌

HepG2細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100U/mL

青霉素和100pg/mL鏈霉素的DMEM髙糖培養(yǎng)基

中，移入CO2培養(yǎng)箱，于37

°C

、體積分?jǐn)?shù)5%CO2

及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.5.2效應(yīng)細(xì)胞小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備摘眼球取

血后，將小鼠浸泡在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中3min,

移至超凈臺(tái)中無菌取脾臟，開左側(cè)腹部皮膚，分

離皮下組織和肌肉，暴露并小心分離脾臟，放入預(yù)

冷PBS中。將脾臟置于200目不銹鋼網(wǎng)上，用注

射器內(nèi)芯頭研磨成單細(xì)胞，收集后1000r/min離

心5min,棄上清，加入3倍量紅細(xì)胞裂解液,4°C靜

置15min,其間輕輕渦旋混勻2次，1000r/min離心

10min,棄上清，預(yù)冷PBS沖洗，含10%胎牛血清的

DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液至不同濃度備用陰。

1.5.3靶細(xì)胞人肝癌HepG2細(xì)胞的標(biāo)記

1.5.3.1CFSE及PI對(duì)靶細(xì)胞的區(qū)分效果6孔板接

種HepG2細(xì)胞，貼壁，至匯合度約為80%,用

5pmol/mL的CFSE標(biāo)記10min,PBS洗

1次，加入

含10%胎牛血清的DMEM髙糖培養(yǎng)基及無水乙醇，

使無水乙醇的終濃度分別為0.4mol/L、0.8mol/L、

1.6mol/L［9］,培養(yǎng)6h后，收集細(xì)胞,PBS沖洗，加入

PI至終濃度為12.5pg/mL,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.3.2CFSE標(biāo)記對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的毒性24

孔板接種HepG2細(xì)胞，貼壁，至匯合度約為80%,

分別以2.5pmol/mL、5.0pmol/mL、10pmol/mL

的CFSE標(biāo)記10min,每隔1h收集細(xì)胞，PBS沖

洗，加入PI至終濃度為12.5pg/mL,上流式細(xì)胞

儀檢測(cè)細(xì)胞存活率，至第18h結(jié)束。未經(jīng)CFSE

標(biāo)記的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.5.3.3CFSE標(biāo)記人肝癌HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的

222實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與

比較更-學(xué)LaboratoryAnimalandComparative

Medicine

Jun.2019，39(3)

時(shí)間動(dòng)力學(xué)分析24孔板接種HepG2細(xì)胞,貼壁

，至

匯合度約為80%,分別以2.5ymol/mL、5.0pmol/mL、

10pmol/mL

的CFSE標(biāo)記10min,每隔1h收集細(xì)

PBS

(Median

24孔板

分析，組間比較采用單因素方養(yǎng)分析（One-Way

ANOVA）講

采用X2t

差界有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

P<0.05為

fluorescentintensity,MFI),至18h結(jié)束。

1.5.4CFSE及PI2結(jié)果

2.1CFSE標(biāo)記對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的作用

2.1.1CFSE及PIX

接種HepG2

的CFSE標(biāo)記10min,PBS洗1

4

80%:

1mL濃

時(shí)HepG2細(xì)胞數(shù)約為4X105/孔。以2.5pmol/mL

106/mL的

PBS沖

12.5|lg/mL,一

,CFSE/PI>

10：1作用6h組：CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-

,

CFSE+PI-為未被乙醇?xì)陌屑?xì)胞，CFSE+PI+

PI

1.5.5

CFSE-PI+CFSE標(biāo)記前

死亡的效應(yīng)細(xì)胞。隨著無水乙醇的濃度逐漸增加，

24孔板接種HepG2細(xì)胞，貼壁，至匯合度約為

80%，此時(shí)HepG2細(xì)胞數(shù)約為4X105/孔。以

2.5|imol/mL的CFSE標(biāo)記10min,PBS洗1次，

1mL濃度為2X106/mL4X106/mL、

CFSE+PI+纟

漸增加（圖1）。

2.1.2CFSE標(biāo)記人肝癌HepG2細(xì)胞的毒性流式

細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，1~18h,各濃度CFSE標(biāo)8X106/mL1.6X107/mL、3.2X10

7/mL、4X

107/mL的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，以效靶比5:1、

10：1、20：1、40：1、80：1、100：1分

別作用6h12h和18h,收集細(xì)胞，PBS沖洗，

PI至終濃度為12.5|ig/mL,一

測(cè)細(xì)胞的存活率，

并按下式計(jì)算殺傷率。

殺傷率（％）=（陰性対照靶細(xì)胞存活率-試驗(yàn)組

HepG2細(xì)

18hCFSE

（2）。

2.1.3CFSE標(biāo)記人肝癌HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的時(shí)

HepG2細(xì)

間動(dòng)力學(xué)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，1~18h,隨

CFSEHepG2

12h

）/100%

MFI,6h

1.6

亍土s表示，用SPSS17.0軟件包

后又有較小范圍波動(dòng)。在6~12h,以2.5|imol/mL

和5.0umol/mL的CFSE標(biāo)記后的MFI{j

圖1CFSE及PI對(duì)靶細(xì)胞區(qū)分效果

Figure1ThedifferentiatingeffectofCFSEand

PIontargetcells

Jun.2019，39(3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較更-學(xué)LaboratoryAnimalandComparativeMedicine223

95

9

0

8

5

—?—0mol/L

-■-2.5mol/L

—*—5.0mol/L

x10mol/L

1718

時(shí)間/h

圖2CFSE對(duì)人HepG2細(xì)胞的毒性

Figure2Thecytotoxicity

ofCFSE

to

humanHepG2cells

(圖3),表明后續(xù)測(cè)定細(xì)胞殺傷活性時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞

6~12h

18h及

6h高；效靶比在40：1以上時(shí)，則殺傷率

隨效靶作用時(shí)間的延長而增加。其中效靶比為

10：112h

2.2CFSE及PI7

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，采用CFSE/PI雙標(biāo)

6h

6

(P<0.01),

記能有效分離殺傷實(shí)驗(yàn)所需各組：CFSE+PI-、

100：1

h

12h

CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-,其中CFSE+PI-

為未被殺傷的靶細(xì)胞，CFSE+PI+;

(P<0.05)(1)。

效靶作用時(shí)間相同時(shí)，細(xì)胞殺傷率總體隨效靶

CFSEPI+；

胞和CFSE標(biāo)記前死亡的效應(yīng)細(xì)胞，CFSE-PI-為效

靶相互作用過程中存活的效應(yīng)細(xì)胞(圖4)。

比的增加而增加，但效靶比在10：1至80：1間

無顯著性養(yǎng)異，直至效靶比上升至100：1時(shí)，殺

:

效靶作用時(shí)間為6h

12h時(shí)

100：1與10：1

(P<0.01)(表1)。

2.3:

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，效靶比在5:1至

40：1

比100：1與10：1相比有顯著性養(yǎng)異(P<0.05),

12h

2

00

o

1000

0

圖3CFSE對(duì)人HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線

Figure3ThetimedynamicsoffluorescentdensityofCFSE-labeledhumanHepG2cells

224實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與

比較更-學(xué)LaboratoryAnimalandComparative

Medicine

<

,

a)

p

-

p

o

-

Jun.2019，39(3)

5

50K100K150K

200

K250K。

lu

n

-p

a

O

Jd

wap-po-:

:

E

4

10

10

10

0

3

.2

p

-s.

0

J

d

O

6.

E

6

3

10

FSC-AComp-CFSE-A::CFSE-A

圖4CFSE及PI對(duì)效靶細(xì)胞區(qū)分效果

Figure4

Thedifferentiatingeffect

ofCFSEandPIoneffectorcellsandtarget

cells

表1效靶作用時(shí)間及效靶比對(duì)細(xì)胞殺傷率的影響

Table1Theeffectofaction

timebetween

effector

andtarget

cellsandtheeffector

totargetcellratiosonthespecific

cellular

killingactivity

效靶作用

時(shí)間/h

效靶

%

比

6

12

18

5：1

34.61土2.29

38.64土0.05

36.90士9.06

10：1

35.32±1.80

20:1

39.74士5.67

48.86土6.23

43.392.51

40：1

39.93士7.39

80：1

44.34±6.63

50.52土13.12

63.727.62

10:1

100:1

50.41土3.53AA

48.78土2.49**

45.798.49

43.65土4.54

43.58

5.31

,

63.60土4.95*人

65.49±8.11

,

A

P<0.05,P<0.01

:,6h,*P<0.05,*P<0.01;

3討論

在建立既能保留腫瘤生物學(xué)特性，且免疫

的各濃度CFSE對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞未見明顯毒

CFSEHepG2細(xì)

MFI6~12h,且效靶作

動(dòng)力學(xué)分析表明，2.5pmol/mL和5.0pmol/mL的

功能相対正常的人腫瘤異種移植動(dòng)物模型的過程

中，我們需要找到一種方便操作的檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞

對(duì)人腫瘤細(xì)胞殺傷作用的方法以應(yīng)對(duì)較大的檢測(cè)需

[10]51CrLDHELISPOT

MHC四]

CFSE

12h6h,丿

12ho

10：1100：1「

,i

能完全滿足本實(shí)驗(yàn)對(duì)殺傷作用檢測(cè)的要求。,

10:1

HepG2細(xì)胞,貼壁，

,I

:24流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種高速

單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)，能對(duì)檢測(cè)的每個(gè)細(xì)胞

進(jìn)行多個(gè)參數(shù)的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過采用適當(dāng)?shù)牟煌?/p>

熒光染料

，即可有效區(qū)分多種細(xì)胞及其存活狀態(tài)，

80%時(shí)

，以

2.5pmol/mL的CFSE標(biāo)記10min,PBS洗1次，加入

含10%DMEM

,而流式細(xì)胞術(shù)這種基于單細(xì)胞水平上的檢測(cè)手段也

保證了多種細(xì)胞共檢測(cè)時(shí)各種細(xì)胞間數(shù)量羞距較大

10:112h,收

集細(xì)胞，PBS,加入PI至終濃度為12.5pg/mL,

時(shí)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

本文對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞對(duì)人HepG2

上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的存活率，并計(jì)算殺傷率。

本方法可有效、精確評(píng)價(jià)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人

肝癌HepG2細(xì)

打下了基礎(chǔ)。

細(xì)胞殺傷活性的方法進(jìn)行了初步的標(biāo)準(zhǔn)化探討：

CFSEPI)

Jun.2019,39(3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較更-學(xué)LaboratoryAnimalandComparativeMedicine225

參考文獻(xiàn)：

[1]AparicioS,HidalgoM,KungAL.

Examiningtheutility

of

patient-derivedxenograftmousemodels

[J].Nat

Rev

Cancer,

2015,15(5):311-316.

[2]Desmond-HellmanS，lanslargecenterfor

PDXmodels[J].

CancerDiscov,2014,4(2):136-137.

[3]AdaGL，nal-selectiontheory[J].Sci

Am，

[6]衛(wèi)江波，徐然然,付志浩，等.疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞殺傷

活性檢測(cè)方法的建立[J].中國生物制品學(xué)雜志,2012,

25

:1680-1683.

(12)

[7]包晶晶，

林海霞,馬璟.CFSE標(biāo)記技術(shù)的研究進(jìn)展[J].免

疫學(xué)雜志,2010,5:461-464.

[8]BocharovG,LuzyaninaT,CupovicJ,et

tryof

celldivisioninCFSE-Basedlymphocyteproliferationanalysis

[J].FrontImmunol,2013,4:264.

1987,257(2):62-69.

[4]+：甫厚，陳紹先,郭彩云，等.LDH釋放法測(cè)NK細(xì)胞毒的

方法學(xué)研究[J].中國免疫學(xué)雜志，1990(2):115-117.

[9]劉英杰，

李景華.低濃度乙醇對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的殺

傷作用[J].解剖學(xué)報(bào),2016,47(2):228-233.

[5]童驍，沈鐵，梁華，等.利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CTL活性方法

在EIAV免疫學(xué)中的應(yīng)用[J].中國病毒學(xué),2005.20(6):642-

[10]李?yuàn)檴?，舒旳

，陳來,等.妊娠小鼠了宮內(nèi)胎鼠腹腔注射人

腫瘤HepG2細(xì)胞對(duì)胎鼠生長發(fā)育的影響[J].中國比較醫(yī)

學(xué)雜志,2018,28(7):33-42.

646.

DevelopmentofaMethodfor

DeterminationofCytotoxicityActivity

ofMouseSplenicLymphocytesonHumanHepG2Cells

CHENLi-Ling,ZHONGYou-Bao,LIUXuan,CHENLai,YUANKe-Wang,HUANGLi-Ting,LIShan-Shan

(JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

[Abstract]ObjectiveTodevelopamethodforevaluationofthecytotoxicityactivityofmicesplenic

lymphocytestohumanHepG2cellsbasedonflowcytometry(FCM),inadditiontoensuretheefficiency

ofevaluationofthecytotoxicityactivityofmicespleniclymphocytestohumanHepG2cellsinthe

processofestablishingananimalmodelofhumantumorxenotransplantation,whichcanpreservethe

biologicalcharacteristicsofhumantumors,meanwhile,hasrelativelynormalimmunefunction.

MethodsHumanHepG2cellswerelabeledwithCFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidyl

ester)andtreatedwithanhydrousethanoltomimicthecytotoxiceffectofcytotoxickillercells,then

determinedbyFCMafterpropidiumiodide(PI)staining,basedonwhichtheconcentratiofCFSEand

phocyteswereisolatedfromspleenofmiceaseffector

durewasdevelopedbased

ontheoptimizationof

conditsThecellswere

dividedintoCFSE+PI-,CFSE+PI+,CFSE-PI+andCFSE-PI-groupsbyCFSE/PIstaining,andthesurvival

/mL,theoptimalaction

timebetweeneffectorandtargetcellswas12h,and

theeffectortotargetcellratiosof10：1was

siAmethodforevaluationofthekillingactivityofmicespleniclymphocytesto

humanHepG2cellsbasedonFCMwassuccessfullydeveloped,whichprovidedareferencefor

evaluatingthekillingeffectofanimalspleniclymphocytesonxenogeneiccells.

[Keywords]Mouse；Spleniclymphocytes；HumanHepG2Cells；Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl

ester(CFSE)；Propidiumiodide(PI)；Flowcytometry(FCM)；Cytotoxicityactivity