肺炎支原體抗體檢測(cè)

（被動(dòng)凝集法）

1.目的：規(guī)范實(shí)驗(yàn)室肺炎支原體抗體檢測(cè)操作。

2.范圍：xxxx院xxxx科

3.測(cè)定原理：

將肺炎支原體（Mac株）的細(xì)胞膜成分致敏人工載體明膠粒子制造而成。這種致敏

粒子和樣本中的肺炎支原體抗體進(jìn)行反應(yīng)發(fā)生凝集，由此可以檢測(cè)出血清和血漿中的

肺炎支原體抗體，并且用來(lái)測(cè)定抗體的效價(jià)。

4.標(biāo)本：

4.1采用正確醫(yī)用技術(shù)收集血清/血漿樣本，血漿樣本推薦使用肝素鈉抗凝血漿，枸櫞酸鈉

和EDTA抗凝劑。

4.2樣本中的沉淀物和懸浮物，紅細(xì)胞等其它有形成分可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)離心除去，

并確定樣本未變質(zhì)方可使用。

4.3嚴(yán)重溶血或脂血的樣本不能用于測(cè)定。

4.4樣本收集后在室溫放置不可超過(guò)8小時(shí)；如果不在8小時(shí)內(nèi)檢測(cè)需將樣本放置在2~8℃

的冰箱中；若需48小時(shí)以上保存或運(yùn)輸，則應(yīng)凍存于-20℃以下，避免反復(fù)凍融。使用前恢

復(fù)到室溫，輕輕搖動(dòng)混勻。

5.試劑：珠海麗珠試劑股份有限公司提供的試劑。

5.1試劑盒在2℃—10℃儲(chǔ)存，防止冷凍，避免強(qiáng)光照射，有效期12個(gè)月。

5.2試劑盒開啟使用后，冷凍干燥品配好后，2℃—10℃保存可使用7日，使用前必須做對(duì)

照試驗(yàn)。

5.3試劑組成

5.3.1血清稀釋液（液體）：用于稀釋樣品和復(fù)溶致敏粒子和未致敏粒子。

5.3.2致敏粒子（冷凍干燥）：肺炎支原體（Mac株）抗原致敏的明膠粒子。使用時(shí)加入規(guī)定

量的血清稀釋液。復(fù)溶后的試劑含有0.9%的致敏粒子。

5.3.3未致敏粒子（冷凍干燥）鞣化的明膠粒子凍干制品。使用時(shí)加入規(guī)定量的血清稀釋液。

5.3.4陽(yáng)性對(duì)照血清（液體）肺炎支原體（Mac株）抗體陽(yáng)性的兔血清用血清稀釋液1:10

稀釋后的制品。

6.臨床標(biāo)本測(cè)定

6.1試劑的準(zhǔn)備

6.1.1溶解液（液體）：按照測(cè)定操作規(guī)則使用。

6.1.2血清稀釋液（液體）：按照測(cè)定操作規(guī)則使用。

6.1.3致敏粒子（冷凍干燥）：加入一定量的溶解液進(jìn)行調(diào)制。請(qǐng)?jiān)谑褂们?0分鐘于室溫

（15~30℃）下進(jìn)行調(diào)制。

6.1.4未致敏粒子（冷凍干燥）：加入一定量的溶解液進(jìn)行調(diào)制。請(qǐng)?jiān)谑褂们?0分鐘于室溫

（15~30℃）下進(jìn)行調(diào)制。

6.1.5陽(yáng)性對(duì)照血清（液體）：按照操作規(guī)則使用。

6.2手工操作步驟

6.2.1用微量滴管將血清稀釋液滴入微量反應(yīng)板第1孔中，共計(jì)4滴（100ul），從第2孔至

第8孔（或更多）各滴入1滴（25ul）血清稀釋液。

6.2.2用微量移液管取樣品25ul至第1孔中，然后用微量加樣器或微量移液管以倍比稀釋

的方式從第1孔稀釋至第8孔中（或更多）。

6.2.3用試劑盒中提供的滴管在第2孔中加入1滴(25ul)未致敏粒子，用另一個(gè)滴管向第3

孔至第8孔（或更多）各加入1滴（25ul）致敏粒子。

6.2.4用平板混勻器以不會(huì)導(dǎo)致微量反應(yīng)板中的檢測(cè)物濺出的強(qiáng)度混合30秒鐘，加蓋后于

室溫（15~30℃）下水平靜置。3個(gè)小時(shí)后，在觀察鏡上記錄并觀察其反應(yīng)圖像，即使靜置

至次日也不影響結(jié)果的判定。

孔號(hào)

血清稀釋液(ul)

樣品（ul）

樣品稀釋倍數(shù)

致敏粒子（ul）

最終稀釋倍數(shù)

1

100

25

1:5

2

25

25

25

3

25

25

25

4

25

25

25

5

25

25

25

6

25

25

25

7

25

25

25

8

25

25

25

1:101:201:401：801:1601:3201:640

未致敏粒子（ul）

1:201:401:801:1601:3201:6401:1280

進(jìn)行混合，蓋上蓋子后靜置反應(yīng)3個(gè)小時(shí)

判定結(jié)果

6.3對(duì)照試驗(yàn)

6.3.1能夠確認(rèn)每例樣品未致敏粒子的反應(yīng)（最終稀釋倍數(shù)1:20）均是（-）

6.3.2能夠確認(rèn)每次檢查中血清稀釋液和致敏粒子以及未致敏粒子的反應(yīng)均是（-）（介質(zhì)對(duì)

照）。

6.3.3每個(gè)試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照血清都要與樣品用相同的測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照血清

調(diào)制成抗體效價(jià)為1：320（最終稀釋倍數(shù)）。

孔號(hào)

血清稀釋液

樣品

樣品稀釋倍數(shù)

致敏粒子（ul）

最終稀釋倍數(shù)

12

50

25

3

25

25

25

4

25

25

25

5

25

25

25

6

25

25

25

7

25

25

25

8

25

25

25

1:101:201:401：801:1601:3201:640

未致敏粒子（ul）

1:201:401:801:1601:3201:6401:1280

進(jìn)行混合，蓋上蓋子后靜置反應(yīng)3個(gè)小時(shí)

判定結(jié)果

6.4吸收操作

對(duì)于未致敏粒子和致敏粒子均顯示（±）以上的凝集樣品，要按照下列順序在完成吸收操作

的基礎(chǔ)上進(jìn)行再試驗(yàn)。

6.4.1取用450ul的血清稀釋液調(diào)制好的未致敏粒子加入小試管中。

6.4.2加入樣品50ul混合，于室溫（15~30℃）下放置30分鐘（孵育期間混合一或兩次）。

6.4.3離心分離（2000rpm，5分鐘），然后分取上清液【吸收完畢的稀釋樣品（1:10）】50ul

至反應(yīng)板第2孔中，特別注意不要混入粒子。

6.4.4從第3孔以后，要預(yù)先各滴入25ul血清稀釋液，從第3孔至最后一孔用微量加樣器

倍比稀釋。以后就與檢驗(yàn)方法中樣品檢測(cè)同樣的操作后進(jìn)行判定。通常情況下可以用上述的

吸收操作吸收完全，但如果吸收不干凈時(shí)，請(qǐng)用其他的檢測(cè)方法。

7.性能指標(biāo):

7.1特異性試驗(yàn)：將室內(nèi)參考品按照規(guī)定程序進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陰性參考品顯示陰性結(jié)果，陽(yáng)性

參考品顯示陽(yáng)性結(jié)果。

7.2靈敏度試驗(yàn)：試劑盒中帶有的陽(yáng)性對(duì)照血清按規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，抗體的效價(jià)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)

值（最終稀釋倍數(shù)1:320）在±1管內(nèi)。

7.3重復(fù)性試驗(yàn)：將室內(nèi)參考品重復(fù)進(jìn)行5次測(cè)定，各抗體效價(jià)最大頻數(shù)在±1管以內(nèi)。

7.4相關(guān)性：取樣品86例陽(yáng)性樣品，用本試劑和FUJIREBIOINC.的間接血凝試驗(yàn)（PHA）檢

測(cè)，一致率96.5%（在一個(gè)對(duì)倍稀釋度內(nèi)）。

8.方法的局限性:

8.1本試劑僅用于檢測(cè)肺炎支原體抗體，不是直接檢測(cè)肺炎支原體，因此陽(yáng)性結(jié)果并不能確

診是肺炎支原體感染。要結(jié)合臨床癥狀分析。

8.2極低量的抗體不能被檢測(cè)出來(lái)，可能會(huì)顯示陰性結(jié)果。當(dāng)懷疑感染時(shí)，即使陰性結(jié)果也

要一段時(shí)間后復(fù)查。

8.3注意前帶現(xiàn)象。

9.檢測(cè)結(jié)果的解釋

9.1反應(yīng)圖像的判定

在判定用觀測(cè)板上靜置微量反應(yīng)板，觀察粒子的反應(yīng)圖像。將反應(yīng)圖像與介質(zhì)比照的圖像進(jìn)

行比較，并參考下表進(jìn)行判斷。

反應(yīng)圖像

粒子成紐扣狀聚集，呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形

粒子形成小環(huán)狀，呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形

粒子形成明顯變大，其外周邊緣不均勻且雜亂的凝集在周圍

產(chǎn)生均一的凝集，凝集粒子在底部整體上呈現(xiàn)膜狀延展

判定

（-）

（±）

（+）

（++）

9.2判定基準(zhǔn)

陽(yáng)性：未致敏粒子（最終稀釋倍數(shù)1:20）的反應(yīng)圖像判定為（-）。致敏粒子（最終稀釋倍

數(shù)1:40以上）的反應(yīng)圖像判定為（+）時(shí)，最終判定為陽(yáng)性。將顯示出反應(yīng)圖像為（+）時(shí)

的最終稀釋倍數(shù)作為抗體滴度。

陰性：無(wú)論未致敏粒子呈現(xiàn)何種反應(yīng)圖像，只要致敏粒子（最終稀釋倍數(shù)1:40）的反應(yīng)圖

像顯示為（-）時(shí)，最終判定為陰性。

保留：未致敏粒子（最終稀釋倍數(shù)1:20）的反應(yīng)圖像判定為（-），且致敏粒子（最終稀釋

倍數(shù)1:40）的反應(yīng)圖像判定為（±）時(shí)，最終判定為保留。

10.注意事項(xiàng)

10.1操作前仔細(xì)閱讀使用說(shuō)明書，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)操作。

10.2避免在惡劣的環(huán)境（如含有84消毒液、次氯酸鈉、酸堿或乙醛等高濃度腐蝕性氣體及

灰塵的環(huán)境）條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

10.3用本試劑判定結(jié)果為保留時(shí)，請(qǐng)用其他的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

10.4本試劑是用來(lái)測(cè)定樣品中的肺炎支原體的抗體效價(jià)，不是用來(lái)測(cè)定肺炎支原體。在判

定為抗體陽(yáng)性的情況下，請(qǐng)結(jié)合其他的檢查結(jié)果以及臨床癥狀來(lái)進(jìn)行綜合判定。

10.5樣本中若存在沉淀物、懸浮物等可見(jiàn)雜質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。此類樣本不得使用。

10.6肺炎支原體感染早期，有可能不產(chǎn)生抗體，或者產(chǎn)生很少量的抗體。如果壞意感染，

即使本試劑的判定結(jié)果為陰性，也要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間再進(jìn)行檢查并且于其他檢查的結(jié)果

和臨床癥狀結(jié)合起來(lái)綜合判定。

10.7試劑需在有效期內(nèi)使用。剩余試劑要及時(shí)密封，放置2~8℃條件下貯存，凍干試劑復(fù)

溶后，最多保存5天。

10.8血清免疫反應(yīng)要注意前區(qū)現(xiàn)象。

10.9服用含有免疫球蛋白血液制品的患者樣品中，由于可能因服用制劑所致的陽(yáng)性反應(yīng)。

要注意判定。

10.10本試劑的溶解液，血清稀釋液和陽(yáng)性對(duì)照血清中含有0.1%的疊氮鈉防腐劑，在廢棄時(shí)

要用大量的水沖洗，避免生成具有爆炸性的金屬疊氮鈉。

10.11不同批號(hào)的試劑絕對(duì)不能混用。

11.臨床意義

肺炎支原體（nia）是人類支原體肺炎的病原體。支原體肺炎的病理改

變以間質(zhì)性肺炎為主，有時(shí)并發(fā)支氣管肺炎，稱為原發(fā)性非典型性肺炎。主要經(jīng)飛沫傳

染，潛伏期2～3周，發(fā)病率以青少年最高。臨床癥狀較輕，甚至根本無(wú)癥狀，若有也

只是頭痛、咽痛、發(fā)熱、咳嗽等一般的呼吸道癥狀。支原體肺炎的臨床表現(xiàn)和胸部X

線檢查并不具特征性，單憑臨床表現(xiàn)和胸部X線檢查無(wú)法做出診斷。若要明確診斷，需

要進(jìn)行病原體的檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)支原體肺炎的診斷主要依靠血清學(xué)檢測(cè)。

12.安全防護(hù)措施及處理：

12.1按要求穿白大褂，帶一次性手套。

12.2處理試劑和樣本時(shí)需戴一次性手套，操作后應(yīng)徹底洗手。所有樣本及使用后的試劑盒

應(yīng)視為潛在的傳染性物質(zhì)，廢棄處理時(shí)，按照當(dāng)?shù)卣陀嘘P(guān)國(guó)家規(guī)定進(jìn)行。

12.3如果發(fā)生污染，視污染范圍，部位選擇合適的處理方法（以下濃度84消毒液均由原液

配置成）：

12.3.1血液標(biāo)本污染臺(tái)面，用7000mg/L的84消毒液浸泡抹布，擦拭污染區(qū)域，小心處理

容器碎片，消毒后置于利器盒內(nèi)

12.3.2血液標(biāo)本濺灑在白大褂上，應(yīng)脫去衣物，并用300mg/L的84消毒液消毒。

12.3.3血液標(biāo)本濺灑在眼睛上，應(yīng)立即用洗眼器沖洗眼部15min后，上報(bào)主任，并去眼科

就診。

12.3.4血液標(biāo)本在離心機(jī)內(nèi)破損，應(yīng)在第一時(shí)間停止離心機(jī)運(yùn)行，待其完全停止后，等

30min內(nèi)部氣溶膠散去，并帶口罩后，用7000mg/L的84消毒液浸泡抹布，擦拭污

染區(qū)域，小心處理容器碎片，消毒后置于利器盒內(nèi)

13.相關(guān)記錄文件

試劑出庫(kù)記錄

14.參考資料

肺炎支原體抗體檢測(cè)（被動(dòng)凝集法）使用說(shuō)明書

編者：審核：批準(zhǔn)：

批準(zhǔn)時(shí)間：2020年07月01日