由于基因測序的不斷進步，科學家們已經(jīng)在我們的遺傳密碼中發(fā)現(xiàn)了幾乎所有的A，T，C和G核苷酸。但是要完全理解人類基因組是如何編碼我們的，我們需要更進一步，繪制每個基因的功能。這是DNA元素百科全書(ENCODE)項目的目標，該項目由國家人類基因組研究所資助，并在2003年人類基因組計劃之后推出。雖然已經(jīng)完成了許多工作 - 映射蛋白質(zhì)-DNA相互作用和不同表觀遺傳狀態(tài)的遺傳 - 理解DNA序列的功能還需要破譯由其編碼的RNA的目的，以及哪些蛋白質(zhì)與這些RNA結合。

這種RNA結合蛋白(RBPs)通過控制各種轉錄后過程來調(diào)節(jié)基因表達 - 指導RNA進入細胞的位置，它們的穩(wěn)定性以及合成的蛋白質(zhì)。然而，這些重要的RNA-蛋白質(zhì)關系仍難以編目，因為大多數(shù)必要的實驗難以完成且難以準確解釋。

在一項新的研究中，麻省理工學院的生物學家團隊及其合作者使用一步，無偏倚的方法描述了78種人類RBP的結合特異性，該方法可以有效而精確地確定這些蛋白質(zhì)所需的RNA序列和結構的光譜。他們的研究結果表明，RBP不僅識別特定的RNA片段，而且通常受到上下文特征的影響，如同所討論的RNA的折疊結構，或RNA結合序列側翼的核苷酸。

“RNA從未在細胞中裸露，因為總有蛋白質(zhì)結合，引導和修飾它，”計算和系統(tǒng)生物學博士生導師Christopher Burge說。該項目，生物學和生物工程教授，科赫綜合癌癥研究所的校外成員，麻省理工學院和哈佛大學廣泛研究所的準成員，以及該研究的高級作者。“如果你真的想要了解轉錄后基因調(diào)控，那么你需要對這些相互作用進行表征。在這里，我們利用深度測序來更準確地描述蛋白質(zhì)與RNA結合的位置和位置。”

麻省理工學院博士后Daniel Dominguez，前研究生Peter Freese和現(xiàn)任研究生Maria Alexis是該研究的主要作者，該研究是ENCODE項目的一部分，于6月7日出現(xiàn)在Molecular Cell上。

一種瘋狂的方法

從RNA誕生的那一刻起，它就被RBP所覆蓋，幾乎控制著生命周期的每個方面。RBP通常含有結合結構域，三維折疊結構，其可附著于稱為基序的RNA上的特定核苷酸序列。因為在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了超過1,500種不同的RBP，生物學家需要一種方法來系統(tǒng)地確定哪些蛋白質(zhì)與哪些RNA基序結合。

在考慮了許多不同的方法來分析RNA-蛋白質(zhì)相互作用，無論是直接在細胞內(nèi)(體內(nèi))還是在試管中分離(體外)，生物學家都采用了一種名為RNA Bind-n-Seq的體外方法( RBNS)，由前Burge實驗室博士后和共同作者Nicole Lambert在四年前開發(fā)的。

盡管蘭伯特之前只測試了一小部分蛋白質(zhì)，但RBNS超越了其他方法，因為它是一種定量方法，揭示了低親和力和高親和力的RNA-蛋白質(zhì)相互作用，只需要一個程序步驟，并篩選幾乎所有可能的RNA基序。這項新研究提高了檢測的通量，系統(tǒng)地以高分辨率探索超過70種人類RBP的結合特異性。

Dominguez說：“即使是最初的小樣本，也很清楚RBNS是要走的路，在過去三年半的時間里，我們逐漸采用這種方法。”“由于單個RBP可以從數(shù)十億個獨特的RNA分子中進行選擇，我們的方法可以為您提供更多的能力來檢測所有可能的目標，同時考慮到RNA二級結構和背景特征。這是一個非常深入和詳細的分析。”

首先，研究人員對人類RBPs進行了純化，將它們與大約20個核苷酸長度的隨機生成的合成RNA混合，這幾乎代表了RBP可以結合的所有RNA。接下來，他們提取了RBP及其結合的RNA并對其進行測序。在加利福尼亞大學圣地亞哥分校和康涅狄格大學健康研究所的合作者的幫助下，該團隊進行了額外的分析，以收集這些RNA-蛋白質(zhì)相互作用在實際細胞中的樣子，并推斷出RBP的細胞功能。

研究人員預計大多數(shù)RBP與獨特的RNA基序結合，但令他們驚訝的是，他們發(fā)現(xiàn)了相反的結果：許多蛋白質(zhì)，無論結構類別如何，似乎都喜歡類似的短的，未展開的核苷酸序列基序。

“人類細胞表達了數(shù)十萬種不同的轉錄本，因此您可能會認為每個RBP都會結合略微不同的RNA序列以區(qū)分目標，”Alexis說。“事實上，人們可能會認為具有不同的RBP基序?qū)⒋_保最大的靈活性。但事實證明，自然界已經(jīng)建立了大量的冗余;多種蛋白質(zhì)似乎結合了相同的短線性序列。”

具有不同目標和功能的冗余圖案

RBP結合偏好的這種重疊向科學家們表明，除了基序序列之外，還必須有一些其他指示物，這些指示物表示RNA靶向的RBP。事實證明，這些信號源于圖案的間距以及其結合位點側翼的核苷酸堿基。對于靶向非線性RNA序列的較不常見的RBP，RNA折疊的精確方式似乎也影響結合特異性。

那么一個顯而易見的問題是：為什么RBP已經(jīng)演變?yōu)橐蕾囉谏舷挛奶卣鞫皇莾H僅賦予它們不同的主題?

可訪問性似乎是更合理的論據(jù)之一。研究人員推斷線性RNA片段在物理上更容易到達，因為它們不受其他RNA鏈的阻礙，并且他們發(fā)現(xiàn)更容易接近的圖案更容易受到限制。另一種可能性是，使許多蛋白質(zhì)靶向相同的基序會產(chǎn)生一些蛋白質(zhì)間的競爭。如果一種蛋白質(zhì)增加RNA穩(wěn)定性而另一種蛋白質(zhì)降低它，那么結合最強的蛋白質(zhì)將阻止另一種蛋白質(zhì)完全結合，從而使細胞或細胞狀態(tài)之間的基因活性發(fā)生更明顯的變化。在其他情況下，具有靶向相同基序的相似功能的蛋白質(zhì)可提供冗余以確保在細胞中發(fā)生調(diào)節(jié)。

“這絕對是一個難題，而且我們可能永遠無法回答這個問題，”多明格斯說。“由于RBP在進化時間內(nèi)重復，可能改變對RNA基序周圍環(huán)境特征的識別比改變整個RNA基序更容易。這將為RBP選擇不同的細胞靶標提供新的機會。”

該研究標志著ENCODE項目的首批體外貢獻之一。雖然體內(nèi)試驗揭示了特定細胞系或其進行組織的特定信息，但RBNS將有助于確定RNA-蛋白質(zhì)相互作用的基本規(guī)則 - 因此它們很可能適用于許多細胞類型和組織。